Внутридисковая инъекция богатой тромбоцитами плазмы (PRP), обогащенной экзосомами, при хронической боли в пояснице

Лечение хронической боли в пояснице (LBP) способствовало ее высокому социально-экономическому уровню. На долю межпозвонкового диска приходится 40% и более случаев хронической боли в пояснице. Доступные варианты лечения не улучшают основное дегенеративное состояние, хотя и устраняют его симптомы. Это указывает на необходимость новых методов лечения и/или вмешательств, которые действительно лечат основные причины дискогенной боли. Биологическая терапия путем прямой инъекции PRP в фиброзное кольцо и студенистое ядро ​​кажется эффективным и выполнимым вариантом.

Экзосомы, полученные из крови, потенциально могут передавать некоторые уникальные свойства стволовых клеток другим стволовым клеткам, способствуя поддержанию стволовости, дифференцировке, самообновлению и восстановлению.

Мы предлагаем провести контролируемое рандомизированное двойное слепое клиническое исследование для сравнения безопасности и эффективности экзосом при БНС. Информированное согласие будет получено от всех субъектов до участия в исследовании.

Подготовка PRP:

Образец крови (60 мл) будет центрифугирован при 600×g в течение 10 минут для сбора фракции плазмы. И центрифугировали при 4000×g в течение 15 мин. Затем удаляют надосадочную плазму с низким содержанием тромбоцитов (PPP), оставляя 1 мл PRP. PPP будет пропускаться через один микрон специального обратного фильтра местной разработки (Alpha Corpuscle, Дели, Индия), так что все тромбоциты, присутствующие во фракции PPP, будут задерживаться в фильтре. Эти захваченные тромбоциты будут смыты обратно 1 мл PPP, чтобы извлечь большую часть тромбоцитов. Это будет смешано вместе, а затем пропущено через фильтр WBC (Terumo Imuguard, США) для фильтрации лейкоцитов. Конечный концентрат PRP (0,1 мл) будет проанализирован на общее количество лейкоцитов и тромбоцитов. Пять образцов будут выбраны случайным образом и обработаны бычьим тромбином, восстановленным в 10% хлориде кальция, и будут оценены на наличие факторов роста [тромбоцитарные факторы роста (PDGF) и факторы роста эндотелия сосудов (VEGF)] с помощью ELISA.

В среднем наш образец PRP будет содержать 100 миллиардов тромбоцитов и 30-кратный концентрат тромбоцитов в 2 мл конечного PRP.

Подготовка экзосом:

Шестьдесят мл крови в пробирках, покрытых ЭДТА, центрифугируют при 1200 g в течение 10 минут при 4°C для отделения плазмы. Плазму фильтруют с помощью фильтра (0,22 мкм). Избегайте любого гранулированного материала при переносе плазмы. Откажитесь от гранулированного материала. Эта пробирка имеет специальный фильтр для концентрации экзосом и других белков, стимулирующих рост. Пробирку центрифугируют при 3000 g, RT, 30 мин, экзосомы собирают и затем концентрируют (от 0,5 мл до 3 мл). Для извлечения экзосом, забившихся в стенке фильтра, добавить 20 мл NS (предпочтительно PBS) в микроцентрифужную пробирку и промыть центрифугированием при 3500 g. Снова соберите концентрированный суп экзосом, застрявших в стенке фильтра.

Количественное определение содержания белка будет проводиться с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA).

Анализ слежения за наночастицами (NTA) Суспензии везикул с концентрациями от 1×107/мл до 1×109/мл будут исследованы с использованием Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Великобритания), оснащенного лазером с длиной волны 405 нм, для определения размера и количества частиц. изолированные. Будет снято видео продолжительностью 60 секунд с частотой кадров 30 кадров/сек, а движение частиц будет проанализировано с использованием программного обеспечения NTA (версия 2.3; NanoSight Ltd.).

Вестерн-блот-анализ Супернатант экзосом денатурируют в буфере для образцов и подвергают вестерн-блот-анализу. Очищенные экзосомы будут проанализированы на экспрессию белка HSP70, флоттилина, CD63, TSG101 и калнексина. Белки визуализировали на системе Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Беркли, Калифорния, США).

Дизайн исследования. Пациенты будут рандомизированы в 2 группы либо для получения PRP с экзосомами в центре студенистого ядра, либо для получения равного количества плацебо, и будут оцениваться 2 врачами, занимающимися интервенционным лечением позвоночника и врачами.

Рандомизация и группы исследования:

Приблизительно триста пациентов будут подвергнуты скринингу для случайного распределения в лечебные или контрольные группы в соотношении 1:1, чтобы распределить по 30 пациентов в каждую из 4 групп:

1. Группа I будет назначена для получения плацебо (инъекция триггерной точки в группе C)

2. Группа II: для получения PRP с экзосомами в центре студенистого ядра (2 мл) Тестируемый продукт(ы), доза и способ введения Продолжительность лечения Пациенты будут выбраны случайным образом на основе сгенерированного компьютером числа для получения одной неразличимой инъекции PRP или плацебо. После дезинфекции кожи спины 2 мл всего полученного PRPex было введено как можно скорее с помощью бокового доступа под рентгеноскопическим контролем. Пациенты получали плацебо аналогичным образом, но не для дискретизации. будет находиться в зоне мышц вокруг триггерной точки. Врач, проводивший оценку исследования, и пациент не знали о лечении. Пациентам рекомендовали продолжать обычные упражнения, обычные меры предосторожности, физиотерапию и уход за спиной.

   Парацетамол (максимум до одного грамма) три раза в день будет разрешено использовать в качестве средства спасения. Никакие системные кортикостероиды, потенциально модифицирующие симптомы препараты/процедуры не будут разрешены во время исследования.

   Оценки исследования / Показатели результатов

   1. Визуальная аналоговая шкала (ВАШ)
   2. Опросник инвалидности Роланда Морриса (RDQ)
   3. Анкета здоровья SF 36
   4. Индекс функционального рейтинга

   5. МРТ - оценка степени дегенерации диска, количественная оценка T2, любые признаки дисцита. Пациенты будут оцениваться по визуальной аналоговой шкале (ВАШ), опроснику здоровья SF 36, индексу функциональной оценки на исходном уровне, а затем через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Структурная эффективность будет оцениваться с помощью количественного определения и классификации t2 на МРТ, как описано ранее в литературе, двумя опытными радиологами на исходном уровне и через 6 месяцев. Оценщики будут ослеплены.

      Мониторинговые визиты будут проводиться в соответствии со стандартными процедурами мониторинга.

      Прекращение лечения по конкретной причине будет установлено. Любые признаки инфекции/дисцита будут тщательно изучены. Ухудшение боли будет глубоко проанализировано.

      Пациенты будут оцениваться на предмет любых побочных эффектов и показателей жизнедеятельности один раз в неделю в течение первого месяца, а затем один раз в месяц до 6 месяцев. Образцы крови были собраны во время включения в исследование, через шесть месяцев и во время последнего визита для изучения биологических показателей, а также функций печени и почек. Оценивали переносимость и проводили лабораторные гематологические и биохимические анализы. Также будет оцениваться возможная причинно-следственная связь с лечебной группой.

      СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ:

      Дисперсионный анализ (ANOVA) будет использоваться для изучения различий между группами. Различия в парных выборках будут сравниваться с использованием двустороннего критерия Стьюдента. Корреляции между переменными будут оцениваться с помощью корреляции Пирсона. Для статистического анализа будет использоваться SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). P<0,05 считается статистически значимым.

      Выявление взаимосвязи между вопросами безопасности/побочными эффектами и уровнем возбуждения с использованием оценочных шкал. Чтобы проверить, различается ли взаимосвязь между проблемами безопасности/побочными эффектами и уровнем возбуждения в группах IBRF ACP/MCP и Standard of Care, используя измерения по рейтинговым шкалам, будут проведены два анализа. Каноническая корреляция будет использоваться для определения того, какой побочный эффект (или комбинация побочных эффектов) объясняет дисперсию в измерениях рейтинговой шкалы. Кроме того, будет использоваться кластерный анализ, чтобы определить, связаны ли побочные эффекты аналогичным образом с уровнями возбуждения и результатами для пациентов в трех группах лечения.

      ПРОЦЕДУРЫ МОНИТОРИНГА/НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ СОБЫТИЙ/КОНЕЧНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ БЕЗОПАСНОСТИ Мониторинг Наблюдатели будут посещать центр во время исследования в дополнение к поддержанию частого телефонного и письменного общения.

      Следующие рекомендации соответствуют требованиям, указанным в 21 CFR §812.46, и предназначены для описания процедур мониторинга клинических исследований. Если исследователь не соблюдает подписанное Соглашение с исследователем, протокол или какое-либо условие исследования (например, неполные формы данных), наблюдатель имеет право прекратить участие исследователя в исследовании.

      Процедуры мониторинга перед исследованием

      Назначаемый (т. монитор) будет нести ответственность за определение и документирование того, что каждый исследователь четко понимает и принимает ответственность и обязательства, возникающие при проведении клинического исследования. Перед началом исследования наблюдатель должен убедиться, что исследователь:

      • Понимает требования к хорошо контролируемому исследованию;

      • Понимает характер клинического протокола

      • Понимает свои обязательства по отчетности;

      • понимает требования к подотчетности устройств;

      • понимает и принимает обязательства по получению информированного согласия в соответствии с 21 CFR, части 50 и 56;

      • Понимает и принимает на себя обязательство получить обзор и одобрение ЭСО клинического исследования до его начала, а также обеспечить постоянный контроль исследования со стороны ЭСО в соответствии с 21 CFR, часть 56, а также информировать спонсора обо всех действиях ЭСО, касающихся учеба;

      • Понимает и принимает требования относительно раскрытия финансовой информации о клинических исследованиях, 21 CFR Part 54;
      • Имеет соответствующие условия и доступ к достаточному количеству подходящих субъектов для проведения расследования;
      • Имеет необходимую документацию, в том числе одобрение IRB и подписанное соглашение о расследовании.

      Периодические контрольные визиты • Контрольные визиты будут проводиться в соответствии с Руководством FDA по мониторингу клинических исследований - январь 1988 г.

      • Наблюдатель должен регулярно посещать каждое место, чтобы убедиться в следующем:

      • Удобства по-прежнему соответствуют требованиям и являются приемлемыми.

      • Протокол соблюдается должным образом.

      • IRB/IEC одобрил или был уведомлен о любых изменениях протокола.

      • Ведется точный, полный и актуальный учет, а информация регистрируется.

      • Предоставляются точные, полные и своевременные отчеты о нежелательных явлениях

      • Получено информированное согласие.

      • Причина выхода субъекта из исследования была задокументирована.

      • Отчеты передаются в IRB и спонсору.

      • Соответствующий персонал проводит учебную деятельность.

      • Все формы отчетов о случаях заболевания и другая документация, связанная с исследованием, будут рассмотрены по получении, и центр будет незамедлительно уведомлен о любых недостатках.

      Частота контрольных визитов a) Контрольные визиты будут проводиться в соответствии со стандартными процедурами мониторинга. Визиты для мониторинга будут определяться на основе нескольких факторов, в том числе: б) Продолжительность исследования; c) количество нерешенных вопросов по результатам предыдущих посещений; г) количество зарегистрированных субъектов; e) количество исследователей/центров; и f) сложность исследования.

      Прекращение исследования Все обычные функции мониторинга должны быть выполнены до визита по окончании исследования. Визит по окончании исследования может быть совмещен с контрольным визитом. Следующие задачи должны быть выполнены во время последнего визита наблюдателя.

   1. Напомните следователю об обязанности сохранять записи. b) Подготовить окончательный отчет о мониторинге для IEC.

   Отчеты о мониторинговых посещениях

   Отчеты о мониторинге должны быть заполнены для всех посещений. Отчеты должны включать следующую информацию:

   а) дата посещения; b) список присутствующих сотрудников исследовательского центра; в) Резюме выводов, проблем