Oxford Nanopore Sequencing を使用した感染診断のための mNGS ワークフローの評価。

診断微生物学は伝統的に感染症を診断するために微生物の培養を必要としていましたが、これは時間がかかり、成長が困難な微生物に対して鈍感であり、以前の抗菌療法によって損なわれました. 主に核酸増幅検査 (NAAT) の形で行われる分子診断。 PCR は、これらの制限のいくつかを克服し、現在では広く使用され、使用が増加しています。 ただし、NAAT ベースのテストは、事前に指定された少数の微生物しか検出できないという制限があり、抗菌薬感受性情報を提供できない場合もあります。

メタゲノム次世代シーケンシング (mNGS) は、微生物学的サンプル中のすべての核酸を直接シーケンシングすることによって機能するため、十分な量で存在するすべての微生物の識別が可能になり、その有無に基づいて抗菌剤感受性パターンを推測できる可能性があります。関連遺伝子。 NAAT とは異なり、標的病原体を事前に特定する必要がないため、mNGS は他の方法ではテストされていない可能性のある重要な病原体を特定できる可能性があります。 ホスト (ヒト) 配列もサンプルに存在するため、配列決定を防止するか、最初の分析ステップで削除することにより、分析から除外されます。

したがって、mNGS は、培養ベースと NAAT ベースの両方の感染診断の限界を克服する能力を備えており、抗菌薬感受性の詳細レベルがより高いレベルで迅速な診断を提供できる可能性があり、微生物が生存可能/培養可能かどうかによる影響が少なくなります。 迅速な感染診断には、患者のケアを大幅に改善する能力があり、それによって適切に標的を絞った抗菌薬療法を迅速に開始できます (または、ウイルス病原体が特定された場合は中止できます)。 抗菌薬耐性が世界的に増加し続けていることを考えると、これは特に重要です。 mNGS による迅速な診断により、他の複数の調査ラインの必要性も減少する可能性があります。 結果の速さ、または臨床的に疑われなかったり、標準的なプロセスでは検出されなかった可能性のある感染症を診断する能力により、この技術が最大の利益を得るために特に対象とすることができる特定の患者グループが存在する可能性があります。 治験責任医師の部門では、最近、診断が遅れたために患者の転帰が非常に悪く、mNGS が転帰を著しく改善する可能性があったいくつかの症例が見られました。 人口レベルでの潜在的な利点もあります。たとえば、人口が過度に広範囲の抗生物質にさらされるのを減らし、公衆衛生上の対応が必要になる可能性のある伝染病を迅速に特定して監視し、適切な管理と患者の流れを促進します。混雑した病院システム。 mNGS には、新しい病原体を検出する機能もあります。 一例として、SARS-CoV-2 に関連する情報の迅速な特定と普及は、迅速な「不可知論的」配列決定技術の利用可能性によるものでした。

次世代シーケンシングは、通常、最前線の診断テストとして使用するには費用がかかりすぎており、その使用は大規模な研究関連機関に限定されていました。 しかし、ナノポアシーケンシング (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) は現在、比較的安価なオプションを提供しており、物理的な設置面積が小さく、大量のシーケンスデータを迅速に生成できるため、最前線の診断微生物学にとって実行可能なオプションとなる可能性があります。研究所。 そのため、mNGS のナノポア シーケンスの使用にかなりの関心があります。 臨床診断への応用については多くの出版物で報告されており、海外ではすでに多くの医療現場で使用されています。

.新しい診断アッセイの評価による継続的な品質改善 (QI) は、臨床検査医学の非常に重要な要素です。 これに沿って、研究者は、診断サービスを強化し、感染診断検査の感度を高め、既存の標準的な診断手順を mNGS と比較するための QI イニシアチブとして、研究室での mNGS の使用を評価することに関心を持っています。 研究者は、外部評価の形でこれを行う予定です。これにより、ウェリントン南部コミュニティ研究所 (WSCL) からのサンプルが mNGS テストのために環境科学研究所 (ESR) に転送されます。 ESR はシーケンシングとバイオインフォマティクスの既存の専門知識を持ち、mNGS 機能を既に開発していますが、実際の患者サンプルでそれを包括的に評価していません。 初期評価は、WSCL で使用できるワークフローを作成することを目的として、ESR で行われます。

サンプルの選択と WSCL から ESR への紹介

1. 定期的な患者ケアの一環として収集され、感染を診断する目的で WSCL 微生物検査室に送られた残留サンプルが使用されます。 ESR などの外部検査室へのサンプルの紹介を含む、診断プロセスを最適化するために、微生物学者が特定の臨床サンプルに対して追加の (要求されていない) 検査を手配することは、検査室で標準的に受け入れられている慣行です。 この評価は同様の手順に従う。
2. サンプルは、プロジェクトに関与する臨床微生物学者によって WSCL で識別されます。 さまざまな種類のサンプルが評価されます。 評価で評価される特定のサンプル タイプは、さまざまなサンプル タイプで mNGS ワークフローがどの程度機能するかに基づいて、評価の過程で異なります。 最初に、通常は無菌の部位からのサンプルと、患者のケアに最大のプラスの影響を与える可能性のあるサンプルが選択されます（例： 脳脊髄液、関節液、胸膜液、血液)、続いて非無菌部位からのサンプル (例: 喀痰、尿、創液など）最初の結果が有望な場合。
3. WSCL は、Capital & Coast および Hutt Valley DHB 地域全体の微生物サンプルを処理するため、サンプルはこれらの地域の患者から調達されます。 サンプルの大部分は、コミュニティベースではなく、入院患者からのものです。 さまざまな臨床専門分野からのサンプルが評価されます。成人および新生児集中治療室、一般病棟患者の両方。

サンプルサイズ 1。 この評価のために特定のサンプル サイズは計算されていません。テストされるサンプルの総数は、mNGS テスト プロセスをどれだけ改良する必要があるかによって決まり、評価は進行中のプロセスである必要がある可能性が高いためです。 調査員は、最大サンプル サイズを 400 に設定しました。

mNGS の方法論

1. 臨床サンプルは、ポリリジンで官能化された固相可逆固定化（SPRI）磁気ビーズを使用して、細菌細胞を濃縮するために処理されます。 ホスト (ヒト) DNA は、示差溶解およびヌクレアーゼ処理を使用して枯渇します。
2. 総核酸は、市販の DNA 抽出キットを使用して処理されたサンプルから抽出されます。
3. ONT ラピッド シーケンシング キットを使用して、得られた DNA の配列を決定します。
4. サンプル内の潜在的な病原体種を特定するために、生成されたすべての非ヒト配列は、カスタマイズされた病原体データベースに対する高速ミニマイザーベースの近似マッピングアルゴリズムを使用して、種レベルに分類学的に分類されます。

宿主（ヒト）ゲノム配列決定の回避 不注意によるヒトゲノム配列決定の可能性を回避するために、いくつかの異なる公表された戦略を含む堅牢なプロセスが導入されます。

1. サンプル中の宿主 DNA の減少:

   を。プロトコルの最初のサンプル処理段階での細菌細胞の濃縮と宿主 DNA の化学的枯渇は、サンプル中の宿主 DNA の量を減らすことによって、ヒト DNA の配列決定を回避する最初の行となります。

2. シーケンサーからホスト DNA を取り出す:

   を。 ホスト シーケンスを削減する 2 番目のフィルターは、ONT 'Read Until' API を使用します。 このプロセスは、検出器を通過する分子の移動方向を 1 秒以内に反転させることで、事前に指定された DNA 配列が検出器に入るのを自動的に防ぎ、完全長の宿主分子が配列決定されるのを防ぎます。 シーケンス データの生のエラー率を考えると、このフィルターを通過する短いホスト読み取りは、分析するのに十分な情報を運びません。

3. ホスト シーケンスの削除:

   を。 ホスト配列を分析にさらすことを避けるための最後のステップは、データストリームが分析ステップに入る前に、生成された残りのヒト配列データを自動的かつ永久に削除することです。

4. 微生物データベースのみに対する配列のマッピング:

   1. 宿主配列が上記のステップを通過するという非常にまれなイベントでは、さらなる安全ステップは、任意の配列が微生物データベースに対してのみマッピングされることです。 これは、ヒトの配列は一致しないため、分析の一部を構成しないことを意味します。

結果報告

1. 結果は、ESR が WSCL に対して実行する他の参照テストに使用されるのと同じ安全な経路を介して、ESR から WSCL に直接報告されます。
2. 結果は、プロジェクトに関与する臨床微生物学者によってレビューされ、臨床チームが結果を利用できるようになる前に、その臨床的関連性の評価を行うことができます。
3. 結果は、臨床チームに報告できるように、WSCL 検査情報システムに入力されます。 テキスト レポートには、結果が mNGS を使用して生成されたものであり、これはまだ評価中であることを説明するコメントが添付されます。結果に不確実性が生じる可能性がある場合、微生物学者は結果に関して臨床チームと直接話し合います。

結果の評価

1. 並行した mNGS 検査の結果は、同じサンプルに対する通常の実験室検査によって生成された結果と時間をかけて比較され、方法間の感度、特異性、および一致レベルが評価されます。 mNGS は通常の方法よりも感度が高い可能性があるため、mNGS の結果は、プロジェクトに関与する臨床微生物学者によって、他の臨床検査、放射線学、および全体的な臨床検査を含む可能性のある他の定期的な診断 (直交) 検査に対しても評価されます。患者の評価。
2. mNGS 検査の臨床的影響も評価され、記録されます。各 mNGS の結果について、臨床微生物学者は、mNGS の結果が患者の全体的な評価と管理に及ぼす臨床的影響について評価を行います。