Evaluering av en mNGS-arbeidsflyt for infeksjonsdiagnose ved bruk av Oxford Nanopore-sekvensering.

Diagnostisk mikrobiologi har tradisjonelt involvert dyrking av organismer for å diagnostisere infeksjon, noe som er tidkrevende, ufølsomt for organismer som er vanskelige å dyrke, og kompromittert av tidligere antimikrobiell terapi. Molekylær diagnostikk, hovedsakelig i form av nukleinsyreamplifikasjonstester (NAAT), f.eks. PCR, overvinner noen av disse begrensningene og er nå i utbredt og økende bruk. NAAT-baserte tester er imidlertid begrenset av kun å kunne oppdage et lite antall forhåndsspesifiserte organismer og kan tilby begrenset til ingen antimikrobiell følsomhetsinformasjon.

Metagenomisk neste generasjons sekvensering (mNGS) fungerer ved å direkte sekvensere all nukleinsyren i en mikrobiologisk prøve, og dermed muliggjøre identifikasjon av alle mikroorganismer som er tilstede i tilstrekkelig mengde, sammen med potensialet til å utlede antimikrobielle mottakelighetsmønstre basert på tilstedeværelse eller fravær av relevante gener. I motsetning til NAAT, kreves ingen forhåndsspesifikasjon av målpatogen(er), så mNGS har potensial til å identifisere viktige patogener som kanskje ikke er testet for ellers. Verts (menneskelige) sekvenser vil også være tilstede i prøven, så de fjernes fra analysen enten ved å forhindre at de blir sekvensert, eller ved å slette dem under de første analysetrinnene.

mNGS har derfor evnen til å overvinne begrensningene for både kulturbasert og NAAT-basert infeksjonsdiagnose, med potensial til å tilby rask diagnostikk med større nivåer av antimikrobiell mottakelighetsdetaljer, som er mindre påvirket av hvorvidt organismen er levedyktig/dyrkbar. Rask infeksjonsdiagnostikk har evnen til å forbedre pasientbehandlingen betydelig, hvorved passende målrettet antimikrobiell behandling kan settes i gang umiddelbart (eller opphøre hvis for eksempel et viralt patogen er identifisert). Dette er spesielt viktig gitt pågående globale økninger i antimikrobiell resistens. Rask diagnostikk med mNGS kan også redusere behovet for flere andre undersøkelseslinjer. Det er sannsynligvis visse grupper av pasienter hvor denne teknologien kan være spesielt målrettet for maksimal fordel enten på grunn av raske resultater eller evnen til å diagnostisere infeksjoner som kanskje ikke er klinisk mistenkt eller oppdaget med standardprosesser. I etterforskernes avdeling har det i det siste vært sett flere tilfeller hvor pasienter har hatt svært dårlige utfall på grunn av forsinkelser i diagnose, hvor mNGS ville ha hatt potensial til å forbedre resultatene sine markant. Det er også potensielle fordeler på befolkningsnivå, som å redusere eksponeringen av befolkningen for altfor bredspektrede antibiotika, rask identifisering og overvåking av smittsomme sykdommer som kan kreve en folkehelserespons, og fremskynde hensiktsmessig behandling og flyt av pasienter gjennom en allerede overbelastet sykehussystem. mNGS har også evnen til å oppdage nye patogener. Som et eksempel skyldtes den raske identifiseringen og spredningen av informasjon knyttet til SARS-CoV-2 tilgjengeligheten av raske 'agnostiske' sekvenseringsteknologier.

Neste generasjons sekvensering har typisk vært for dyr til å brukes som en diagnostisk test i frontlinjen, med bruken begrenset til større forskningstilknyttede institusjoner. Imidlertid tilbyr nanopore-sekvensering (Oxford Nanopore Technologies [ONT]), nå et relativt billig alternativ, med et lite fysisk fotavtrykk og en evne til å generere en stor mengde sekvensdata raskt, noe som gjør det til et potensielt levedyktig alternativ for diagnostisk mikrobiologi i frontlinjen. laboratorier. Som sådan er det betydelig interesse for bruk av nanopore-sekvensering for mNGS. En rekke publikasjoner har rapportert om bruken i klinisk diagnostikk, og den er allerede i bruk i en rekke helsetjenester i utlandet

. Kontinuerlig kvalitetsforbedring (QI) via evaluering av nye diagnostiske analyser er en kritisk viktig komponent i klinisk laboratoriemedisin. I tråd med dette er etterforskerne interessert i å evaluere bruken av mNGS i laboratoriet deres som et QI-initiativ for å forbedre den diagnostiske tjenesten, øke sensitiviteten til infeksjonsdiagnostisk testing og sammenligne eksisterende standard diagnostiske prosedyrer mot mNGS. Etterforskerne planlegger å gjennomføre dette i form av en ekstern evaluering, der prøver fra Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) vil bli videresendt til Institute of Environmental Sciences and Research (ESR) for mNGS-testing. ESR har eksisterende ekspertise innen sekvensering og bioinformatikk og har allerede utviklet mNGS-evne, men har ikke evaluert det på reelle pasientprøver. Den første evalueringen ville skje ved ESR, med sikte på å produsere en arbeidsflyt som kan være brukbar på WSCL.

Prøvevalg og henvisning fra WSCL til ESR

1. Restprøver som har blitt samlet inn som en del av rutinemessig pasientbehandling og sendt til WSCLs mikrobiologiske laboratorium for å diagnostisere infeksjon, vil bli brukt. Det er standard akseptert praksis i laboratoriet for mikrobiologen å arrangere ytterligere (uønsket) testing på visse kliniske prøver for å optimere den diagnostiske prosessen, inkludert henvisning av prøver til et eksternt laboratorium som ESR. Denne evalueringen vil følge en lignende prosedyre.
2. Prøver vil bli identifisert ved WSCL av den eller de kliniske mikrobiologene som er involvert i prosjektet. En rekke utvalgstyper vil bli evaluert. De spesifikke prøvetypene som vil bli vurdert i evalueringen vil variere i løpet av evalueringen, basert på hvor godt mNGS-arbeidsflyten fungerer på ulike prøvetyper. Til å begynne med vil prøver fra normalt sterile steder og de med potensielt størst positiv innvirkning på pasientbehandlingen bli valgt (f.eks. cerebrospinalvæske, leddvæske, pleuravæske, blod) etterfulgt av prøver fra ikke-sterile steder (f.eks. sputum, urin, sårvæsker) hvis de første resultatene er oppmuntrende.
3. WSCL behandler mikrobiologiske prøver for hele Capital & Coast og Hutt Valley DHB-regioner, så prøver vil bli hentet fra pasienter i disse regionene. Flertallet av prøvene vil være fra sykehusinnlagte pasienter, snarere enn lokalsamfunnsbaserte. Prøver fra en rekke ulike kliniske spesialiteter vil bli evaluert, inkludert utvidede omsorgsenheter f.eks. både voksen- og nyfødtintensivavdelinger, og generelle avdelingspasienter.

Prøvestørrelse 1. En spesifikk prøvestørrelse er ikke beregnet for denne evalueringen, da det totale antallet prøver som testes vil være avhengig av hvor mye foredling av mNGS-testprosessen som kreves, og evalueringen må sannsynligvis være en pågående prosess. Etterforskerne har satt en maksimal prøvestørrelse på 400.

mNGS-metodikk

1. Kliniske prøver vil bli behandlet for å berike for bakterieceller ved bruk av fastfase reversible immobilisering (SPRI) magnetiske kuler funksjonalisert med polylysin. Verts (humant) DNA vil bli utarmet ved bruk av differensiell lysis og nukleasebehandling.
2. Total nukleinsyre vil bli ekstrahert fra de behandlede prøvene ved å bruke kommersielt tilgjengelige DNA-ekstraksjonssett.
3. ONT hurtigsekvenseringssett vil bli brukt til å sekvensere det resulterende DNA.
4. For å identifisere potensielle patogenarter i prøven, vil alle genererte ikke-menneskelige sekvenser bli taksonomisk klassifisert til artsnivå ved hjelp av en rask minimiserbasert omtrentlig kartleggingsalgoritme mot tilpassede patogendatabaser.

Unngå sekvensering av vertsgenom (menneskelig) Robuste prosesser som involverer flere forskjellige publiserte strategier vil bli satt i verk for å unngå muligheten for utilsiktet sekvensering av humant genom.

1. Reduserende verts-DNA i prøven:

   en. Bakteriecelleanrikning og kjemisk uttømming av verts-DNA under det første prøvebehandlingsstadiet av protokollen vil være den første linjen for å unngå sekvensering av humant DNA ved å redusere mengden verts-DNA i prøven.

2. Utstøting av verts-DNA fra sekvenseren:

   en. Det andre filteret for å redusere vertssekvensering vil bruke ONT 'Read Til' API. Denne prosessen forhindrer automatisk forhåndsspesifiserte DNA-sekvenser fra å komme inn i detektoren ved å reversere molekylets reiseretning gjennom detektoren innen mindre enn ett sekund, og forhindrer at vertsmolekyler i full lengde blir sekvensert. Gitt den rå feilraten til sekvensdataene, har alle korte vertslesninger som passerer dette filteret utilstrekkelig informasjon til å bli analysert.

3. Sletting av vertssekvenser:

   en. Det siste trinnet for å unngå å utsette vertssekvensen for analyse er automatisk og permanent sletting av eventuelle gjenværende humane sekvensdata etter hvert som de produseres, før datastrømmen går inn i analysetrinnet.

4. Kartlegging av sekvenser kun mot mikrobielle databaser:

   1. I det svært usannsynlige tilfellet at vertssekvensen passerer trinnene ovenfor, er et ytterligere sikkerhetstrinn at eventuelle sekvenser kun vil bli kartlagt mot mikrobielle databaser. Dette betyr at noen menneskelige sekvenser ikke vil skape et samsvar, så vil ikke inngå i analysen.

Rapportering av resultater

1. Resultater vil bli rapportert av ESR direkte til WSCL via de samme sikre banene som brukes for annen referansetesting som ESR utfører for WSCL.
2. Resultatene vil bli vurdert av den eller de kliniske mikrobiologene som er involvert i prosjektet, slik at en vurdering av deres kliniske relevans kan gjøres før resultatene gjøres tilgjengelige for kliniske team.
3. Resultatene vil bli lagt inn i WSCL-laboratorieinformasjonssystemet slik at de kan rapporteres til det kliniske teamet. En kommentar vil bli vedlagt tekstrapporten som forklarer at resultatene er generert ved hjelp av mNGS, som fortsatt er under evaluering, og mikrobiologen vil diskutere direkte med det kliniske teamet angående resultatene dersom det er potensial for usikkerhet rundt resultatet.

Evaluering av resultater

1. Resultatene av den parallelle mNGS-testingen vil bli sammenlignet over tid med resultatene produsert av rutinemessige laboratorietester på samme prøve, for å vurdere sensitiviteten, spesifisiteten og nivået av samsvar mellom metodene. Gitt at mNGS potensielt er mer sensitiv enn rutinemetoder, vil mNGS-resultater også bli vurdert av den eller de kliniske mikrobiologene som er involvert i prosjektet mot annen rutinemessig diagnostisk (ortogonal) testing, som kan inkludere andre laboratorietester, radiologi og den generelle kliniske testen. vurdering av pasienten.
2. Den kliniske effekten av mNGS-testingen vil også bli vurdert og registrert: for hvert mNGS-resultat vil den eller de kliniske mikrobiologene foreta en vurdering av den kliniske innvirkningen mNGS-resultatet hadde på den generelle vurderingen og behandlingen av pasienten.