Infektiodiagnoosin mNGS-työnkulun arviointi Oxford Nanopore -sekvensointia käyttämällä.

Diagnostinen mikrobiologia on perinteisesti käyttänyt organismien viljelyä infektion diagnosoimiseen, mikä on aikaa vievää, epäherkkää organismeille, joita on vaikea kasvattaa ja jota aikaisempi antimikrobinen hoito vaarantaa. Molekyylidiagnostiikka, pääasiassa nukleiinihappoamplifikaatiotestien (NAAT) muodossa, esim. PCR:llä voitetaan jotkin näistä rajoituksista, ja ne ovat nyt laajassa ja lisääntyvässä käytössä. NAAT-pohjaisia ​​testejä rajoittaa kuitenkin se, että ne pystyvät havaitsemaan vain pienen määrän ennalta määritettyjä organismeja, ja ne voivat tarjota vain vähän tietoa mikrobien herkkyydestä.

Metagenominen seuraavan sukupolven sekvensointi (mNGS) toimii sekvensoimalla suoraan kaikki mikrobiologisessa näytteessä olevat nukleiinihapot, mikä mahdollistaa kaikkien riittävässä määrin läsnä olevien mikro-organismien tunnistamisen sekä mahdollisuuden päätellä mikrobien herkkyysmalleja mikrobien läsnäolon tai puuttumisen perusteella. relevantteja geenejä. Toisin kuin NAAT, kohdepatogeenin (patogeenien) esispesifikaatiota ei vaadita, joten mNGS:llä on potentiaalia tunnistaa tärkeitä patogeenejä, joita ei ehkä ole muuten testattu. Näytteessä on myös isäntä (ihmisen) sekvenssejä, joten ne poistetaan analyysistä joko estämällä niiden sekvensointi tai poistamalla ne alkuanalyysivaiheiden aikana.

mNGS pystyy näin ollen voittamaan sekä viljelypohjaisen että NAAT-pohjaisen infektiodiagnoosin rajoitukset ja mahdollistaa nopean diagnoosin, jossa on enemmän antimikrobisen herkkyyden yksityiskohtia, joihin vaikuttaa vähemmän se, onko organismi elinkelpoinen/viljelty. Nopealla infektiodiagnostiikan avulla voidaan merkittävästi parantaa potilaiden hoitoa, jolloin asianmukaisesti kohdennettu antimikrobinen hoito voidaan aloittaa viipymättä (tai lopettaa, jos esim. viruspatogeeni tunnistetaan). Tämä on erityisen tärkeää, kun otetaan huomioon, että antimikrobinen resistenssi lisääntyy maailmanlaajuisesti. Nopea diagnostiikka mNGS:llä voi myös vähentää useiden muiden tutkimuslinjojen tarvetta. Tietyissä potilasryhmissä tämä tekniikka voidaan todennäköisesti kohdistaa erityisesti maksimaalisen hyödyn saavuttamiseen joko tulosten nopeuden tai kyvyn diagnosoida infektioita, joita ei ehkä ole kliinisesti epäilty tai havaittu tavanomaisilla prosesseilla. Tutkijoiden osastolla on viime aikoina havaittu useita tapauksia, joissa potilaiden tulokset ovat olleet erittäin huonoja diagnoosin viivästymisen vuoksi, jolloin mNGS:llä olisi ollut potentiaalia parantaa merkittävästi heidän tuloksiaan. Potentiaalisia hyötyjä on myös väestötasolla, kuten väestön liian laajakirjoisille antibiooteille altistumisen vähentäminen, tartuntatautien nopea tunnistaminen ja seuranta, jotka saattavat vaatia kansanterveystoimia, sekä nopeuttaa asianmukaista hoitoa ja potilaiden virtausta jo valmiiksi ruuhkautunut sairaalajärjestelmä. mNGS:llä on myös kyky havaita uusia patogeenejä. Esimerkiksi SARS-CoV-2:een liittyvän tiedon nopea tunnistaminen ja levittäminen johtui nopeiden "agnostisten" sekvensointitekniikoiden saatavuudesta.

Seuraavan sukupolven sekvensointi on tyypillisesti ollut liian kallista käytettäväksi eturivin diagnostisena testinä, ja sen käyttö rajoittuu suurempiin tutkimusalan instituutioihin. Nanohuokosekvensointi (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) tarjoaa kuitenkin nyt suhteellisen edullisen vaihtoehdon, jolla on pieni fyysinen jalanjälki ja kyky tuottaa suuri määrä sekvenssidataa nopeasti, mikä tekee siitä mahdollisesti käyttökelpoisen vaihtoehdon eturivin diagnostiselle mikrobiologialle. laboratoriot. Sellaisenaan on olemassa huomattavaa kiinnostusta nanohuokosekvensoinnin käyttöön mNGS:ssä. Useissa julkaisuissa on raportoitu sen käytöstä kliinisessä diagnostiikassa, ja se on jo käytössä useissa terveydenhuollon ympäristöissä ulkomailla

. Jatkuva laadun parantaminen (QI) uusien diagnostisten määritysten arvioinnin avulla on kliinisen laboratoriolääketieteen ratkaisevan tärkeä osa. Tämän mukaisesti tutkijat ovat kiinnostuneita arvioimaan mNGS:n käyttöä laboratoriossaan QI-aloitteena diagnostisen palvelun tehostamiseksi, infektiodiagnostiikan testauksen herkkyyden lisäämiseksi ja olemassa olevien standardidiagnostisten menetelmien vertailemiseksi mNGS:ään. Tutkijat aikovat toteuttaa tämän ulkoisen arvioinnin muodossa, jossa Wellington Southern Community Laboratoriesin (WSCL) näytteet välitettäisiin Institute of Environmental Sciences and Researchille (ESR) mNGS-testausta varten. ESR:llä on jo olemassa olevaa asiantuntemusta sekvensoinnista ja bioinformatiikasta, ja se on jo kehittänyt mNGS-kyvyn, mutta ei ole arvioinut sitä kattavasti oikeilla potilasnäytteillä. Alkuarviointi suoritettaisiin ESR:ssä tavoitteena tuottaa työnkulku, jota voitaisiin käyttää WSCL:ssä.

Näytteen valinta ja lähetys WSCL:stä ESR:ään

1. Käytetään jäännösnäytteet, jotka on kerätty osana rutiinipotilaiden hoitoa ja lähetetty WSCL:n mikrobiologian laboratorioon infektion diagnosointia varten. Laboratoriossa on yleisesti hyväksytty käytäntö, että mikrobiologi järjestää tietyille kliinisille näytteille lisätestejä (ei-pyyntöä) diagnostisen prosessin optimoimiseksi, mukaan lukien näytteiden lähettäminen ulkoiseen laboratorioon, kuten ESR:ään. Tässä arvioinnissa noudatetaan samanlaista menettelyä.
2. Näytteet tunnistavat WSCL:ssä hankkeeseen osallistuvat kliiniset mikrobiologit. Erilaisia ​​näytetyyppejä arvioidaan. Arvioinnissa arvioitavat otostyypit vaihtelevat arvioinnin aikana sen mukaan, kuinka hyvin mNGS-työnkulku toimii eri näytetyypeissä. Aluksi valitaan näytteet normaalisti steriileistä paikoista ja niistä, joilla on mahdollisesti suurin positiivinen vaikutus potilaan hoitoon (esim. aivo-selkäydinneste, nivelneste, keuhkopussin neste, veri), jota seuraa näytteet ei-steriileistä kohdista (esim. yskös, virtsa, haavanesteet), jos ensimmäiset tulokset ovat rohkaisevia.
3. WSCL käsittelee mikrobiologisia näytteitä koko Capital & Coastin ja Hutt Valleyn DHB-alueiden osalta, joten näytteet hankittaisiin näiden alueiden potilailta. Suurin osa näytteistä on sairaalahoidossa olevilta potilailta eivätkä yhteisöpohjaisia. Arvioidaan näytteitä useilta eri kliinisiltä erikoisaloilta, mukaan lukien lisähoidon yksiköt mm. sekä aikuisten että vastasyntyneiden tehohoitoyksiköt sekä yleisosaston potilaat.

Näytteen koko 1. Tätä arviointia varten ei ole laskettu tiettyä otoskokoa, koska testattujen näytteiden kokonaismäärä riippuu siitä, kuinka paljon mNGS-testausprosessia tarvitaan, ja arvioinnin on todennäköisesti oltava jatkuva prosessi. Tutkijat ovat asettaneet otoksen enimmäiskoon 400.

mNGS-metodologia

1. Kliiniset näytteet käsitellään bakteerisolujen rikastamiseksi käyttämällä polylysiinillä funktionalisoituja SPRI-magneettihelmiä. Isännän (ihmisen) DNA tyhjennetään käyttämällä differentiaalista lyysiä ja nukleaasikäsittelyä.
2. Kokonaisnukleiinihappo uutetaan käsitellyistä näytteistä käyttämällä kaupallisesti saatavia DNA-uuttopakkauksia.
3. Tuloksena olevan DNA:n sekvensointiin käytetään ONT-pikasekvensointipakkausta.
4. Mahdollisten taudinaiheuttajalajien tunnistamiseksi näytteestä kaikki luodut ei-ihmissekvenssit luokitellaan taksonomisesti lajitasolle käyttämällä nopeaa minimointiin perustuvaa likimääräistä kartoitusalgoritmia räätälöityjä patogeenitietokantoja vastaan.

Isännän (ihmisen) genomin sekvensoinnin välttäminen Voimakkaita prosesseja, joihin liittyy useita erilaisia ​​julkaistuja strategioita, otetaan käyttöön tahattoman ihmisen genomin sekvensoinnin välttämiseksi.

1. Isäntä-DNA:n pelkistys näytteessä:

   a. Bakteerisolujen rikastuminen ja isäntä-DNA:n kemiallinen ehtyminen protokollan näytteenkäsittelyn alkuvaiheessa ovat ensimmäinen keino välttää ihmisen DNA:n sekvensointi vähentämällä isäntä-DNA:n määrää näytteessä.

2. Isäntä-DNA:n poistaminen sekvensaattorista:

   a. Toinen isäntäjärjestystä vähentävä suodatin käyttää ONT "Lue asti" -sovellusliittymää. Tämä prosessi estää automaattisesti ennalta määritettyjen DNA-sekvenssien pääsyn detektoriin kääntämällä molekyylin kulkusuunnan detektorin läpi alle sekunnissa, mikä estää täyspitkien isäntämolekyylien sekvensoinnin. Sekvenssitietojen raakavirhesuhteen vuoksi kaikki tämän suodattimen läpäisevät lyhyet isäntälukemat sisältävät riittämättömästi analysoitavaa tietoa.

3. Isäntäsekvenssien poistaminen:

   a. Viimeinen vaihe, jolla vältetään isäntäsekvenssin altistaminen analyysille, on automaattisesti ja pysyvästi kaikki jäljelle jääneet ihmisen sekvenssitiedot, kun niitä tuotetaan, ennen kuin datavirta tulee analyysivaiheeseen.

4. Sekvenssien kartoitus vain mikrobitietokantoihin:

   1. Siinä hyvin epätodennäköisessä tapauksessa, että isäntäsekvenssi läpäisee yllä olevat vaiheet, lisäturvavaihe on, että kaikki sekvenssit kartoitetaan vain mikrobitietokantoihin. Tämä tarkoittaa, että mitkään ihmisen sekvenssit eivät luo yhteensopivuutta, joten ne eivät olisi osa analyysiä.

Tulosten raportointi

1. ESR raportoi tulokset suoraan WSCL:lle samojen suojattujen reittien kautta, joita käytetään muihin vertailutesteihin, joita ESR suorittaa WSCL:lle.
2. Projektiin osallistuvat kliiniset mikrobiologit arvioivat tulokset, jotta niiden kliininen merkitys voidaan arvioida ennen kuin tulokset asetetaan kliinisten ryhmien saataville.
3. Tulokset syötetään WSCL:n laboratoriotietojärjestelmään, jotta ne voidaan raportoida kliiniselle tiimille. Tekstiraporttiin liitetään kommentti, jossa selitetään, että tulokset on tuotettu mNGS:llä, jota vielä arvioidaan, ja mikrobiologi keskustelee tuloksista suoraan kliinisen tiimin kanssa, mikäli tulokseen liittyy epävarmuutta.

Tulosten arviointi

1. Rinnakkaisen mNGS-testauksen tuloksia verrataan ajan mittaan tuloksiin, jotka on saatu rutiinilaboratoriotesteissä samasta näytteestä, jotta voidaan arvioida menetelmien herkkyys, spesifisyys ja yhteensopivuus. Koska mNGS on mahdollisesti herkempi kuin rutiinimenetelmät, hankkeeseen osallistuvat kliiniset mikrobiologit arvioivat mNGS-tulokset myös muihin rutiininomaisiin diagnostisiin (ortogonaalisiin) testeihin, jotka voivat sisältää muita laboratoriotutkimuksia, radiologiaa ja yleistä kliinistä tutkimusta. potilaan arviointi.
2. Myös mNGS-testauksen kliininen vaikutus arvioidaan ja kirjataan: jokaisesta mNGS-tuloksesta kliininen mikrobiologi(t) tekee arvion mNGS-tuloksen kliinisestä vaikutuksesta potilaan kokonaisarviointiin ja hoitoon.