Оценка рабочего процесса mNGS для диагностики инфекций с использованием секвенирования Oxford Nanopore.

Диагностическая микробиология традиционно использовала культуру организмов для диагностики инфекции, что требует много времени, нечувствительно к организмам, которые трудно вырастить, и скомпрометировано предшествующей противомикробной терапией. Молекулярная диагностика, преимущественно в виде тестов на амплификацию нуклеиновых кислот (МАНК), т.е. ПЦР преодолевают некоторые из этих ограничений и в настоящее время широко используются. Однако тесты на основе МАНК ограничены тем, что могут обнаруживать лишь небольшое количество предварительно определенных организмов и могут предоставлять ограниченную информацию о чувствительности к противомикробным препаратам или вообще не давать ее.

Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) работает путем прямого секвенирования всей нуклеиновой кислоты в микробиологическом образце, что позволяет идентифицировать все микроорганизмы, которые присутствуют в достаточном количестве, а также позволяет делать выводы о моделях чувствительности к противомикробным препаратам на основе наличия или отсутствия микроорганизмов. соответствующие гены. В отличие от МАНК, предварительная спецификация целевого патогена (патогенов) не требуется, поэтому mNGS может идентифицировать важные патогены, которые иначе не были бы проверены. Последовательности хозяина (человека) также будут присутствовать в образце, поэтому они удаляются из анализа либо путем предотвращения их секвенирования, либо путем их удаления на начальных этапах анализа.

Таким образом, mNGS обладает способностью преодолевать ограничения диагностики инфекций как на основе посева, так и на основе МАНК, предлагая быструю диагностику с более высоким уровнем детализации чувствительности к противомикробным препаратам, на которую меньше влияет жизнеспособность / культивируемость организма. Быстрая диагностика инфекций может значительно улучшить уход за пациентами, благодаря чему можно быстро начать адекватную таргетную противомикробную терапию (или прекратить ее, если, например, выявлен вирусный возбудитель). Это имеет особое значение, учитывая продолжающийся глобальный рост устойчивости к противомикробным препаратам. Быстрая диагностика с помощью mNGS также может снизить потребность во множестве других направлений исследований. Вероятно, существуют определенные группы пациентов, для которых эта технология может быть особенно нацелена на максимальную пользу либо из-за быстроты результатов, либо из-за возможности диагностировать инфекции, которые не подозревались клинически или не обнаруживались с помощью стандартных процессов. В исследовательском отделе недавно наблюдалось несколько случаев, когда у пациентов были очень плохие результаты из-за задержек в диагностике, когда mNGS мог бы заметно улучшить их результаты. Существуют также потенциальные выгоды на популяционном уровне, такие как снижение экспозиции населения к антибиотикам чрезмерно широкого спектра действия, быстрое выявление и эпиднадзор за инфекционными заболеваниями, которые могут потребовать ответных мер со стороны общественного здравоохранения, а также ускорение надлежащего лечения и потока пациентов через уже перегруженная больничная система. mNGS также обладает способностью обнаруживать новые патогены. Например, быстрая идентификация и распространение информации, касающейся SARS-CoV-2, были обусловлены наличием технологий быстрого «независимого» секвенирования.

Секвенирование следующего поколения, как правило, было слишком дорогим, чтобы его можно было использовать в качестве передового диагностического теста, поскольку его использование ограничивалось более крупными исследовательскими учреждениями. Тем не менее, секвенирование нанопор (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) в настоящее время предлагает относительно недорогой вариант с небольшой физической площадью и возможностью быстро генерировать большой объем данных секвенирования, что делает его потенциально жизнеспособным вариантом для передовой диагностической микробиологии. лаборатории. Таким образом, существует значительный интерес к использованию секвенирования нанопор для mNGS. В ряде публикаций сообщалось о его использовании в клинической диагностике, и он уже используется в ряде зарубежных медицинских учреждений.

. Непрерывное улучшение качества (QI) посредством оценки новых диагностических тестов является критически важным компонентом клинической лабораторной медицины. В соответствии с этим исследователи заинтересованы в оценке использования mNGS в своей лаборатории в качестве инициативы по обеспечению качества для улучшения диагностических услуг, повышения чувствительности диагностических тестов на инфекции и сравнения существующих стандартных диагностических процедур с mNGS. Исследователи планируют провести это в форме внешней оценки, в результате чего образцы из лабораторий Южного сообщества Веллингтона (WSCL) будут отправлены в Институт экологических наук и исследований (ESR) для тестирования mNGS. ESR обладает опытом секвенирования и биоинформатики и уже разработала возможности mNGS, однако еще не всесторонне оценила их на реальных образцах пациентов. Первоначальная оценка будет проводиться в ESR с целью создания рабочего процесса, который можно было бы использовать в WSCL.

Отбор проб и направление из WSCL в ESR

1. Будут использоваться остаточные образцы, которые были собраны в рамках обычного ухода за пациентами и отправлены в микробиологическую лабораторию WSCL для диагностики инфекции. Стандартной практикой в ​​лаборатории является проведение микробиологом дополнительных (незапрошенных) анализов определенных клинических образцов для оптимизации диагностического процесса, включая направление образцов во внешнюю лабораторию, например, в СОЭ. Эта оценка будет проходить по аналогичной процедуре.
2. Образцы будут идентифицированы в WSCL клиническим микробиологом (ами), участвующими в проекте. Будут оцениваться различные типы образцов. Конкретные типы образцов, которые будут оцениваться в ходе оценки, будут меняться в ходе оценки в зависимости от того, насколько хорошо рабочий процесс mNGS работает с различными типами образцов. Первоначально будут выбраны образцы из обычно стерильных мест и тех, которые потенциально могут оказать наибольшее положительное влияние на уход за пациентом (например, спинномозговая жидкость, суставная жидкость, плевральная жидкость, кровь), а затем образцы из нестерильных участков (например, мокрота, моча, раневые жидкости), если первоначальные результаты обнадеживают.
3. WSCL обрабатывает микробиологические образцы для всех регионов DHB Capital & Coast и Hutt Valley, поэтому образцы будут получены от пациентов в этих регионах. Большинство образцов будет взято у госпитализированных пациентов, а не у населения. Будут оцениваться образцы из различных клинических специальностей, включая отделения расширенной медицинской помощи, например. отделения интенсивной терапии для взрослых и новорожденных, а также для пациентов общего профиля.

Размер выборки 1. Конкретный размер выборки для этой оценки не рассчитывался, так как общее количество протестированных образцов будет зависеть от того, насколько требуется уточнение процесса тестирования mNGS, и оценка, вероятно, должна быть непрерывным процессом. Исследователи установили максимальный размер выборки в 400 человек.

методология mNGS

1. Клинические образцы будут обработаны для обогащения бактериальными клетками с использованием твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI) магнитных шариков, функционализированных полилизином. ДНК хозяина (человека) будет истощена с помощью дифференциального лизиса и обработки нуклеазами.
2. Суммарная нуклеиновая кислота будет извлечена из обработанных образцов с использованием имеющихся в продаже наборов для выделения ДНК.
3. Набор для быстрого секвенирования ONT будет использоваться для секвенирования полученной ДНК.
4. Чтобы идентифицировать потенциальные виды патогенов в образце, все сгенерированные нечеловеческие последовательности будут таксономически классифицированы на уровне видов с использованием быстрого алгоритма приблизительного сопоставления на основе минимайзера с настроенными базами данных патогенов.

Предотвращение секвенирования генома хозяина (человека) Будут внедрены надежные процессы, включающие несколько различных опубликованных стратегий, чтобы избежать возможности непреднамеренного секвенирования генома человека.

1. Восстановление ДНК хозяина в образце:

   а. Обогащение бактериальных клеток и химическое истощение ДНК хозяина на начальном этапе обработки образца протокола будет первой линией, позволяющей избежать секвенирования ДНК человека за счет уменьшения количества ДНК хозяина в образце.

2. Извлечение ДНК хозяина из секвенатора:

   а. Вторым фильтром для уменьшения последовательности хостов будет использование API ONT «Чтение до». Этот процесс автоматически предотвращает попадание предварительно заданных последовательностей ДНК в детектор, изменяя направление движения молекулы через детектор менее чем за одну секунду, предотвращая секвенирование любых полноразмерных молекул-хозяев. Учитывая необработанную частоту ошибок данных последовательности, любые короткие чтения хоста, которые проходят этот фильтр, содержат недостаточно информации для анализа.

3. Удаление последовательностей узлов:

   а. Последним шагом, позволяющим избежать подвергания последовательности хозяина анализу, является автоматическое и окончательное удаление любых остаточных данных человеческой последовательности по мере их создания до того, как поток данных войдет в этап анализа.

4. Сопоставление последовательностей только с микробными базами данных:

   1. В очень маловероятном случае, если последовательность хозяина пройдет вышеуказанные шаги, дальнейшим шагом безопасности является то, что любые последовательности будут сопоставлены только с микробными базами данных. Это означает, что любые человеческие последовательности не будут создавать совпадения, поэтому не будут являться частью анализа.

Отчет о результатах

1. Результаты будут переданы ESR непосредственно в WSCL по тем же безопасным путям, которые используются для других эталонных тестов, которые ESR выполняет для WSCL.
2. Результаты будут рассмотрены клиническими микробиологами, участвующими в проекте, чтобы можно было провести оценку их клинической значимости до того, как результаты будут доступны для клинических групп.
3. Результаты будут внесены в лабораторную информационную систему WSCL, чтобы о них можно было сообщить клинической команде. К текстовому отчету будет приложен комментарий, объясняющий, что результаты были получены с использованием mNGS, который все еще оценивается, и микробиолог напрямую обсудит результаты с клинической командой, если есть какая-либо вероятность неопределенности в отношении результата.

Оценка результатов

1. Результаты параллельного тестирования mNGS будут со временем сравниваться с результатами, полученными при обычном лабораторном тестировании того же образца, для оценки чувствительности, специфичности и уровня согласованности между методами. Учитывая, что mNGS потенциально более чувствителен, чем обычные методы, результаты mNGS также будут оцениваться клиническими микробиологами, участвующими в проекте, по сравнению с другими рутинными диагностическими (ортогональными) тестами, которые могут включать другие лабораторные тесты, рентгенологию и общие клинические исследования. оценка пациента.
2. Клиническое влияние тестирования mNGS также будет оцениваться и регистрироваться: для каждого результата mNGS клинический микробиолог (и) будет проводить оценку клинического влияния результата mNGS на общую оценку и ведение пациента.