Ocena przepływu pracy mNGS w diagnostyce infekcji przy użyciu sekwencjonowania Oxford Nanopore.

Mikrobiologia diagnostyczna tradycyjnie obejmowała hodowlę organizmów w celu zdiagnozowania infekcji, co jest czasochłonne, niewrażliwe na organizmy trudne w hodowli i zagrożone wcześniejszą terapią przeciwdrobnoustrojową. Diagnostyka molekularna, głównie w postaci testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), m.in. PCR przezwyciężają niektóre z tych ograniczeń i są obecnie w powszechnym i rosnącym użyciu. Testy oparte na NAAT są jednak ograniczone, ponieważ są w stanie wykryć tylko niewielką liczbę wcześniej określonych organizmów i mogą dostarczyć ograniczone lub żadne informacje na temat wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) działa poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie całego kwasu nukleinowego w próbce mikrobiologicznej, umożliwiając w ten sposób identyfikację wszystkich mikroorganizmów obecnych w wystarczającej ilości, wraz z możliwością wnioskowania o wzorcach wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w oparciu o obecność lub brak odpowiednie geny. W przeciwieństwie do NAAT, nie jest wymagana wstępna specyfikacja docelowego patogenu (patogenów), więc mNGS ma potencjał do identyfikacji ważnych patogenów, które mogły nie zostać przetestowane w inny sposób. Sekwencje gospodarza (ludzkie) będą również obecne w próbce, więc są usuwane z analizy albo poprzez uniemożliwienie ich sekwencjonowania, albo usunięcie ich podczas początkowych etapów analizy.

W związku z tym mNGS ma zdolność przezwyciężenia ograniczeń diagnostyki infekcji opartej zarówno na hodowli, jak i na podstawie NAAT, z możliwością oferowania szybkiej diagnostyki z większym poziomem szczegółowości wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, na którą w mniejszym stopniu wpływa to, czy organizm jest zdolny do życia / hodowli. Szybka diagnostyka infekcji może znacznie poprawić opiekę nad pacjentem, dzięki czemu można szybko rozpocząć (lub przerwać) odpowiednio ukierunkowaną terapię przeciwdrobnoustrojową (lub przerwać ją w przypadku zidentyfikowania np. patogenu wirusowego). Ma to szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę trwający globalny wzrost oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Szybka diagnostyka za pomocą mNGS może również zmniejszyć potrzebę wielu innych linii badań. Prawdopodobnie istnieją pewne grupy pacjentów, w przypadku których technologia ta może być szczególnie ukierunkowana w celu uzyskania maksymalnych korzyści ze względu na szybkość uzyskiwania wyników lub możliwość diagnozowania infekcji, których nie podejrzewano klinicznie ani nie wykryto za pomocą standardowych procesów. W dziale badaczy zaobserwowano ostatnio kilka przypadków, w których pacjenci mieli bardzo złe wyniki z powodu opóźnień w diagnozie, gdzie mNGS miałby potencjał do znacznej poprawy ich wyników. Istnieją również potencjalne korzyści na poziomie populacji, takie jak zmniejszenie narażenia ludności na antybiotyki o zbyt szerokim spektrum działania, szybka identyfikacja i nadzór nad chorobami zakaźnymi, które mogą wymagać reakcji ze strony zdrowia publicznego, oraz przyspieszenie odpowiedniego zarządzania i przepływu pacjentów przez już przeciążony system szpitalny. mNGS ma również zdolność wykrywania nowych patogenów. Na przykład szybka identyfikacja i rozpowszechnianie informacji dotyczących SARS-CoV-2 była spowodowana dostępnością szybkich „agnostycznych” technologii sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie nowej generacji było zwykle zbyt drogie, aby można je było stosować jako test diagnostyczny pierwszej linii, a jego zastosowanie ograniczało się do większych instytucji powiązanych z badaniami. Jednak sekwencjonowanie nanoporów (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) oferuje obecnie stosunkowo niedrogą opcję, z niewielkim fizycznym śladem i możliwością szybkiego generowania dużej ilości danych sekwencyjnych, co czyni go potencjalnie realną opcją dla mikrobiologii diagnostycznej pierwszej linii laboratoria. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem sekwencjonowania nanoporów dla mNGS. W wielu publikacjach opisano jego zastosowanie w diagnostyce klinicznej i jest on już używany w wielu placówkach opieki zdrowotnej za granicą

. Ciągła poprawa jakości (QI) poprzez ocenę nowych testów diagnostycznych jest niezwykle ważnym elementem klinicznej medycyny laboratoryjnej. W związku z tym badacze są zainteresowani oceną wykorzystania mNGS w ich laboratorium jako inicjatywy QI w celu ulepszenia usług diagnostycznych, zwiększenia czułości testów diagnostycznych infekcji i porównania istniejących standardowych procedur diagnostycznych z mNGS. Badacze planują przeprowadzić to w formie zewnętrznej oceny, w ramach której próbki z Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) zostaną przesłane do Instytutu Nauk o Środowisku i Badań (ESR) w celu przetestowania mNGS. ESR dysponuje istniejącą wiedzą specjalistyczną w zakresie sekwencjonowania i bioinformatyki oraz rozwinął już możliwości mNGS, jednak nie ocenił ich kompleksowo na rzeczywistych próbkach pacjentów. Wstępna ocena miałaby miejsce w ESR w celu stworzenia przepływu pracy, który mógłby być użyteczny w WSCL.

Dobór próby i skierowanie z WSCL do ESR

1. Wykorzystane zostaną próbki resztkowe, które zostały pobrane w ramach rutynowej opieki nad pacjentem i przesłane do laboratorium mikrobiologicznego WSCL w celu zdiagnozowania zakażenia. Standardową przyjętą praktyką w laboratorium jest organizowanie przez mikrobiologa dodatkowych (niewymaganych) badań niektórych próbek klinicznych w celu optymalizacji procesu diagnostycznego, w tym kierowanie próbek do zewnętrznego laboratorium, takiego jak ESR. Ocena ta przebiegałaby według podobnej procedury.
2. Próbki zostaną zidentyfikowane w WSCL przez mikrobiologów klinicznych zaangażowanych w projekt. Oceniane będą różne rodzaje próbek. Konkretne typy próbek, które zostaną ocenione podczas oceny, będą się różnić w trakcie oceny, w zależności od tego, jak dobrze przepływ pracy mNGS działa na różnych typach próbek. Początkowo zostaną wybrane próbki z miejsc normalnie sterylnych i tych, które mają potencjalnie największy pozytywny wpływ na opiekę nad pacjentem (np. płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy, płyn opłucnowy, krew), a następnie próbki z miejsc niesterylnych (np. plwocina, mocz, płyny z ran), jeśli wstępne wyniki są zachęcające.
3. WSCL przetwarza próbki mikrobiologiczne z całych regionów DHB Capital & Coast i Hutt Valley, więc próbki będą pochodzić od pacjentów z tych regionów. Większość próbek będzie pochodzić od pacjentów hospitalizowanych, a nie ze społeczności. Ocenione zostaną próbki z różnych specjalności klinicznych, w tym oddziałów opieki rozszerzonej, m.in. oddziałów intensywnej terapii dorosłych i noworodków oraz pacjentów oddziałów ogólnych.

Wielkość próbki 1. Do tej oceny nie obliczono określonej wielkości próbki, ponieważ całkowita liczba przetestowanych próbek będzie uzależniona od tego, jak bardzo wymagane jest udoskonalenie procesu testowania mNGS, a ocena prawdopodobnie będzie musiała być procesem ciągłym. Badacze ustalili maksymalną wielkość próbki na 400.

metodologia mNGS

1. Próbki kliniczne zostaną przetworzone w celu wzbogacenia w komórki bakteryjne przy użyciu kulek magnetycznych odwracalnych immobilizacji w fazie stałej (SPRI) funkcjonalizowanych polilizyną. DNA gospodarza (ludzkiego) zostanie zubożone przy użyciu lizy różnicowej i traktowania nukleazą.
2. Całkowity kwas nukleinowy zostanie wyekstrahowany z przetworzonych próbek przy użyciu dostępnych w handlu zestawów do ekstrakcji DNA.
3. Do sekwencjonowania otrzymanego DNA zostanie użyty zestaw do szybkiego sekwencjonowania ONT.
4. Aby zidentyfikować potencjalne gatunki patogenów w próbce, wszystkie wygenerowane sekwencje inne niż ludzkie zostaną taksonomicznie sklasyfikowane na poziomie gatunku przy użyciu szybkiego przybliżonego algorytmu mapowania opartego na minimalizatorach w oparciu o dostosowane bazy danych patogenów.

Unikanie sekwencjonowania genomu gospodarza (ludzkiego) Aby uniknąć możliwości przypadkowego sekwencjonowania genomu ludzkiego, wprowadzone zostaną solidne procesy obejmujące kilka różnych opublikowanych strategii.

1. Zmniejszenie DNA gospodarza w próbce:

   A. Wzbogacanie komórek bakteryjnych i chemiczne usuwanie DNA gospodarza podczas początkowego etapu przetwarzania próbki w protokole będzie pierwszą linią unikania sekwencjonowania ludzkiego DNA poprzez zmniejszenie ilości DNA gospodarza w próbce.

2. Wyrzucanie DNA gospodarza z sekwencera:

   A. Drugim filtrem mającym na celu ograniczenie sekwencjonowania hostów będzie użycie interfejsu API ONT „Odczyt do”. Proces ten automatycznie zapobiega przedostawaniu się określonych sekwencji DNA do detektora poprzez odwrócenie kierunku przemieszczania się cząsteczki przez detektor w czasie krótszym niż jedna sekunda, zapobiegając sekwencjonowaniu cząsteczek gospodarza pełnej długości. Biorąc pod uwagę surowy poziom błędów danych sekwencji, wszelkie krótkie odczyty hosta, które przejdą ten filtr, zawierają niewystarczające informacje do analizy.

3. Usuwanie sekwencji gospodarzy:

   A. Ostatnim krokiem mającym na celu uniknięcie wystawiania sekwencji gospodarza na analizę jest automatyczne i trwałe usunięcie wszelkich resztkowych danych sekwencji ludzkich w trakcie ich tworzenia, zanim strumień danych wejdzie do etapu analizy.

4. Mapowanie sekwencji tylko w bazach danych drobnoustrojów:

   1. W bardzo mało prawdopodobnym przypadku, gdy sekwencja gospodarza przejdzie powyższe etapy, kolejnym etapem bezpieczeństwa jest to, że wszelkie sekwencje będą mapowane tylko w bazach danych drobnoustrojów. Oznacza to, że żadne ludzkie sekwencje nie stworzyłyby dopasowania, więc nie stanowiłyby części analizy.

Raportowanie wyników

1. Wyniki zostaną przekazane przez ESR bezpośrednio do WSCL za pośrednictwem tych samych bezpiecznych ścieżek, które są używane do innych testów referencyjnych, które ESR wykonuje dla WSCL.
2. Wyniki zostaną zweryfikowane przez mikrobiologów klinicznych zaangażowanych w projekt, aby można było dokonać oceny ich przydatności klinicznej przed udostępnieniem wyników zespołom klinicznym.
3. Wyniki zostaną wprowadzone do laboratoryjnego systemu informacyjnego WSCL, aby można je było zgłosić zespołowi klinicznemu. Do raportu tekstowego zostanie dołączony komentarz wyjaśniający, że wyniki zostały wygenerowane przy użyciu mNGS, który wciąż jest oceniany, a mikrobiolog omówi bezpośrednio z zespołem klinicznym wyniki, jeśli istnieje jakakolwiek niepewność związana z wynikiem.

Ocena wyników

1. Wyniki równoległych testów mNGS będą z czasem porównywane z wynikami rutynowych badań laboratoryjnych na tej samej próbce, aby ocenić czułość, swoistość i poziom zgodności między metodami. Biorąc pod uwagę, że mNGS jest potencjalnie bardziej czuły niż metody rutynowe, wyniki mNGS będą również oceniane przez mikrobiologów klinicznych zaangażowanych w projekt w porównaniu z innymi rutynowymi (ortogonalnymi) badaniami diagnostycznymi, które mogą obejmować inne badania laboratoryjne, radiologiczne i ogólną ocenę kliniczną ocena pacjenta.
2. Kliniczny wpływ testu mNGS również zostanie oceniony i odnotowany: dla każdego wyniku mNGS mikrobiolodzy kliniczni dokonają oceny wpływu klinicznego wyniku mNGS na ogólną ocenę i postępowanie z pacjentem.