Avaliação de um Workflow de mNGS para Diagnóstico de Infecção Usando Oxford Nanopore Sequencing.

A microbiologia diagnóstica envolve tradicionalmente a cultura de organismos para diagnosticar a infecção, que é demorada, insensível a organismos de difícil crescimento e comprometida pela terapia antimicrobiana anterior. Diagnóstico molecular, predominantemente na forma de testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT), por ex. PCR, superam algumas dessas limitações e estão agora em uso generalizado e crescente. No entanto, os testes baseados em NAAT são limitados por serem capazes de detectar apenas um pequeno número de organismos pré-especificados e podem oferecer informações de suscetibilidade antimicrobiana limitadas ou inexistentes.

O sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS) funciona sequenciando diretamente todo o ácido nucleico em uma amostra microbiológica, permitindo assim a identificação de todos os microorganismos que estão presentes em quantidade suficiente, juntamente com o potencial de inferir padrões de suscetibilidade antimicrobiana com base na presença ou ausência de genes relevantes. Ao contrário do NAAT, nenhuma pré-especificação do(s) patógeno(s) alvo é necessária, então o mNGS tem o potencial de identificar patógenos importantes que podem não ter sido testados de outra forma. As sequências hospedeiras (humanas) também estarão presentes na amostra, portanto, são removidas da análise, impedindo-as de serem sequenciadas ou excluindo-as durante as etapas iniciais da análise.

O mNGS, portanto, tem a capacidade de superar as limitações do diagnóstico de infecção baseado em cultura e NAAT, com o potencial de oferecer diagnósticos rápidos com maiores níveis de detalhes de suscetibilidade antimicrobiana, que é menos afetado pelo fato de o organismo ser viável/culturável. O diagnóstico rápido de infecção tem a capacidade de melhorar significativamente o atendimento ao paciente, por meio do qual a terapia antimicrobiana apropriadamente direcionada pode ser instituída prontamente (ou cessada se, por exemplo, um patógeno viral for identificado). Isso é de particular importância, dado o aumento global contínuo da resistência antimicrobiana. O diagnóstico rápido com mNGS também pode reduzir a necessidade de várias outras linhas de investigação. É provável que haja certos grupos de pacientes nos quais essa tecnologia pode ser particularmente direcionada para benefício máximo devido à rapidez dos resultados ou à capacidade de diagnosticar infecções que podem não ter sido clinicamente suspeitas ou detectadas com processos padrão. No departamento de investigadores, vários casos foram observados recentemente em que os pacientes tiveram resultados muito ruins devido a atrasos no diagnóstico, onde o mNGS teria o potencial de melhorar acentuadamente seus resultados. Existem também benefícios potenciais em nível populacional, como a redução da exposição da população a antibióticos de amplo espectro, identificação e vigilância rápidas de doenças transmissíveis que podem exigir uma resposta de saúde pública e agilizar o gerenciamento e o fluxo apropriados de pacientes por meio de um sistema já existente. sistema hospitalar congestionado. O mNGS também tem a capacidade de detectar novos patógenos. Por exemplo, a rápida identificação e disseminação de informações relacionadas ao SARS-CoV-2 deveu-se à disponibilidade de tecnologias de sequenciamento "agnóstico" rápido.

O sequenciamento de próxima geração costuma ser muito caro para ser usado como um teste de diagnóstico de linha de frente, com seu uso confinado a instituições maiores afiliadas à pesquisa. No entanto, o sequenciamento de nanoporos (Oxford Nanopore Technologies [ONT]), agora oferece uma opção relativamente barata, com uma pequena pegada física e uma capacidade de gerar uma grande quantidade de dados de sequência rapidamente, tornando-se uma opção potencialmente viável para microbiologia de diagnóstico de linha de frente laboratórios. Como tal, há um interesse considerável no uso de sequenciamento de nanoporos para mNGS. Várias publicações relataram seu uso em diagnósticos clínicos e já está em uso em vários ambientes de saúde no exterior

. A Melhoria Contínua da Qualidade (QI) através da avaliação de novos ensaios de diagnóstico é um componente extremamente importante da medicina laboratorial clínica. Em consonância com isso, os investigadores estão interessados ​​em avaliar o uso de mNGS em seu laboratório como uma iniciativa de QI para melhorar o serviço de diagnóstico, aumentar a sensibilidade do teste de diagnóstico de infecção e comparar os procedimentos de diagnóstico padrão existentes contra mNGS. Os investigadores planejam fazer isso na forma de uma avaliação externa, em que amostras dos Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) seriam encaminhadas ao Instituto de Ciências e Pesquisas Ambientais (ESR) para testes mNGS. A ESR possui experiência em sequenciamento e bioinformática e já desenvolveu a capacidade mNGS, mas não a avaliou de forma abrangente em amostras reais de pacientes. A avaliação inicial ocorreria na ESR, com o objetivo de produzir um fluxo de trabalho que pudesse ser utilizado na WSCL.

Seleção de amostras e encaminhamento de WSCL para ESR

1. Serão utilizadas amostras residuais que foram coletadas como parte da rotina de atendimento ao paciente e enviadas ao laboratório de microbiologia da WSCL para fins de diagnóstico de infecção. É prática padrão aceita no laboratório que o microbiologista providencie testes adicionais (não solicitados) em certas amostras clínicas para otimizar o processo de diagnóstico, incluindo o encaminhamento de amostras para um laboratório externo, como ESR. Esta avaliação seguiria um procedimento semelhante.
2. As amostras serão identificadas no WSCL pelo(s) microbiologista(s) clínico(s) envolvido(s) no projeto. Uma variedade de tipos de amostra será avaliada. Os tipos de amostra específicos que serão avaliados na avaliação irão variar durante o curso da avaliação, com base em quão bem o fluxo de trabalho do mNGS funciona em diferentes tipos de amostra. Inicialmente, serão escolhidas amostras de locais normalmente estéreis e aqueles com potencial de maior impacto positivo no atendimento ao paciente (por exemplo, líquido cefalorraquidiano, líquido articular, líquido pleural, sangue) seguido de amostras de locais não estéreis (p. escarro, urina, fluidos de feridas) se os resultados iniciais forem encorajadores.
3. A WSCL processa amostras de microbiologia para todas as regiões de Capital & Coast e Hutt Valley DHB, de modo que as amostras seriam provenientes de pacientes nessas regiões. A maioria das amostras será de pacientes hospitalizados, e não da comunidade. Amostras de uma variedade de diferentes especialidades clínicas serão avaliadas, incluindo unidades de cuidados aumentados, por exemplo. unidades de terapia intensiva adulto e neonatal e pacientes de enfermaria geral.

Tamanho da amostra 1. Um tamanho de amostra específico não foi calculado para esta avaliação, pois o número total de amostras testadas dependerá de quanto refinamento do processo de teste mNGS é necessário, e a avaliação provavelmente precisará ser um processo contínuo. Os investigadores estabeleceram um tamanho máximo de amostra em 400.

metodologia mNGS

1. Amostras clínicas serão processadas para enriquecimento de células bacterianas usando esferas magnéticas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI) funcionalizadas com poli-lisina. O DNA do hospedeiro (humano) será esgotado usando lise diferencial e tratamento com nuclease.
2. O ácido nucleico total será extraído das amostras processadas usando kits de extração de DNA disponíveis comercialmente.
3. O kit de sequenciamento rápido ONT será utilizado para sequenciar o DNA resultante.
4. Para identificar potenciais espécies de patógenos na amostra, todas as sequências não humanas geradas serão classificadas taxonomicamente para o nível de espécie usando um algoritmo de mapeamento aproximado baseado em minimizador rápido contra bancos de dados de patógenos personalizados.

Evitar o sequenciamento do genoma do hospedeiro (humano) Processos robustos envolvendo várias estratégias publicadas diferentes serão implementados para evitar a possibilidade de sequenciamento inadvertido do genoma humano.

1. Reduzindo o DNA do hospedeiro na amostra:

   a. O enriquecimento de células bacterianas e o esgotamento químico do DNA do hospedeiro durante o estágio inicial de processamento da amostra do protocolo serão a primeira linha para evitar o sequenciamento do DNA humano, reduzindo a quantidade de DNA do hospedeiro na amostra.

2. Ejetando o DNA do hospedeiro do sequenciador:

   a. O segundo filtro para reduzir o sequenciamento de host será o uso da API ONT 'Read Until'. Esse processo evita automaticamente que sequências de DNA pré-especificadas entrem no detector, invertendo a direção da passagem da molécula pelo detector em menos de um segundo, evitando que qualquer molécula hospedeira de comprimento total seja sequenciada. Dada a taxa de erro bruta dos dados da sequência, qualquer leitura curta do host que passe por esse filtro carrega informações insuficientes para serem analisadas.

3. Excluindo sequências de host:

   a. A etapa final para evitar a exposição da sequência do hospedeiro à análise é a exclusão automática e permanente de quaisquer dados residuais da sequência humana à medida que são produzidos, antes de o fluxo de dados entrar na etapa de análise.

4. Mapeamento de sequências apenas contra bancos de dados microbianos:

   1. No caso muito improvável de a sequência do hospedeiro passar pelas etapas acima, outra etapa de segurança é que todas as sequências serão mapeadas apenas em bancos de dados microbianos. Isso significa que nenhuma sequência humana criaria uma correspondência e, portanto, não faria parte da análise.

Relatórios de resultados

1. Os resultados serão relatados pelo ESR diretamente ao WSCL por meio dos mesmos caminhos seguros usados ​​para outros testes de referência que o ESR executa para o WSCL.
2. Os resultados serão revisados ​​pelo(s) microbiologista(s) clínico(s) envolvido(s) no projeto para que uma avaliação de sua relevância clínica possa ser feita antes que os resultados sejam disponibilizados para as equipes clínicas.
3. Os resultados serão inseridos no sistema de informações laboratoriais WSCL para que possam ser relatados à equipe clínica. Um comentário será anexado ao relatório de texto explicando que os resultados foram gerados usando mNGS, que ainda está sendo avaliado, e o microbiologista discutirá diretamente com a equipe clínica sobre os resultados se houver qualquer potencial de incerteza em torno do resultado.

Avaliação de resultados

1. Os resultados do teste mNGS paralelo serão comparados ao longo do tempo com os resultados produzidos por testes laboratoriais de rotina na mesma amostra, para avaliar a sensibilidade, especificidade e nível de concordância entre os métodos. Dado que o mNGS é potencialmente mais sensível do que os métodos de rotina, os resultados do mNGS também serão avaliados pelo(s) microbiologista(s) clínico(s) envolvido(s) no projeto em relação a outros testes diagnósticos de rotina (ortogonais), que podem incluir outros testes laboratoriais, radiológicos e a avaliação clínica geral avaliação do paciente.
2. O impacto clínico do teste de mNGS também será avaliado e registrado: para cada resultado de mNGS, o(s) microbiologista(s) clínico(s) fará(ão) uma avaliação quanto ao impacto clínico que o resultado de mNGS teve na avaliação geral e no manejo do paciente.