Évaluation d'un flux de travail mNGS pour le diagnostic d'infection à l'aide du séquençage Oxford Nanopore.

La microbiologie diagnostique a traditionnellement impliqué la culture d'organismes pour diagnostiquer l'infection, ce qui prend du temps, est insensible aux organismes difficiles à cultiver et compromis par une thérapie antimicrobienne antérieure. Diagnostic moléculaire, principalement sous la forme de tests d'amplification d'acide nucléique (NAAT), par ex. La PCR surmonte certaines de ces limitations et est maintenant largement et de plus en plus utilisée. Les tests basés sur le TAAN sont cependant limités car ils ne peuvent détecter qu'un petit nombre d'organismes pré-spécifiés et peuvent offrir des informations limitées ou nulles sur la sensibilité aux antimicrobiens.

Le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) fonctionne en séquençant directement tout l'acide nucléique dans un échantillon microbiologique, permettant ainsi l'identification de tous les micro-organismes présents en quantité suffisante, ainsi que la possibilité de déduire des schémas de sensibilité aux antimicrobiens basés sur la présence ou l'absence de gènes concernés. Contrairement au TAAN, aucune spécification préalable du ou des agents pathogènes cibles n'est requise, de sorte que le mNGS a le potentiel d'identifier des agents pathogènes importants qui n'auraient peut-être pas été testés autrement. Des séquences hôtes (humaines) seront également présentes dans l'échantillon, elles sont donc supprimées de l'analyse soit en les empêchant d'être séquencées, soit en les supprimant lors des étapes d'analyse initiales.

Le mNGS a donc la capacité de surmonter les limites du diagnostic d'infection basé sur la culture et le TAAN, avec le potentiel d'offrir des diagnostics rapides avec des niveaux plus élevés de détails sur la sensibilité aux antimicrobiens, qui sont moins affectés par le fait que l'organisme est viable/cultivable. Le diagnostic rapide des infections a la capacité d'améliorer considérablement les soins aux patients, grâce auquel une thérapie antimicrobienne ciblée de manière appropriée peut être instituée rapidement (ou arrêtée si, par exemple, un agent pathogène viral est identifié). Cela revêt une importance particulière compte tenu de l'augmentation mondiale continue de la résistance aux antimicrobiens. Des diagnostics rapides avec mNGS peuvent également réduire le besoin de plusieurs autres pistes d'investigation. Il est probable qu'il y ait certains groupes de patients pour lesquels cette technologie peut être particulièrement ciblée pour un bénéfice maximal, soit en raison de la rapidité des résultats, soit de la capacité à diagnostiquer des infections qui n'ont peut-être pas été cliniquement suspectées ou détectées avec des processus standard. Dans le département des investigateurs, plusieurs cas ont été vus récemment où les patients ont eu de très mauvais résultats en raison de retards de diagnostic, où le mNGS aurait eu le potentiel d'améliorer considérablement leurs résultats. Il existe également des avantages potentiels au niveau de la population, tels que la réduction de l'exposition de la population à des antibiotiques à trop large spectre, l'identification et la surveillance rapides des maladies transmissibles qui peuvent nécessiter une réponse de santé publique, et l'accélération de la gestion appropriée et du flux de patients à travers un système déjà système hospitalier congestionné. mNGS a également la capacité de détecter de nouveaux agents pathogènes. À titre d'exemple, l'identification et la diffusion rapides des informations relatives au SRAS-CoV-2 étaient dues à la disponibilité de technologies de séquençage « agnostiques » rapides.

Le séquençage de nouvelle génération a généralement été trop coûteux pour être utilisé comme test de diagnostic de première ligne, son utilisation étant limitée aux grandes institutions affiliées à la recherche. Cependant, le séquençage des nanopores (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) offre désormais une option relativement peu coûteuse, avec une faible empreinte physique et une capacité à générer rapidement une grande quantité de données de séquence, ce qui en fait une option potentiellement viable pour la microbiologie diagnostique de première ligne. laboratoires. En tant que tel, il existe un intérêt considérable pour l'utilisation du séquençage des nanopores pour mNGS. Un certain nombre de publications ont rendu compte de son utilisation dans les diagnostics cliniques, et il est déjà utilisé dans un certain nombre d'établissements de soins de santé à l'étranger

. L'amélioration continue de la qualité (AQ) via l'évaluation de nouveaux tests de diagnostic est un élément essentiel de la médecine de laboratoire clinique. Dans cette optique, les chercheurs souhaitent évaluer l'utilisation du mNGS dans leur laboratoire en tant qu'initiative d'amélioration de la qualité pour améliorer le service de diagnostic, augmenter la sensibilité des tests de diagnostic des infections et comparer les procédures de diagnostic standard existantes au mNGS. Les enquêteurs prévoient d'entreprendre cela sous la forme d'une évaluation externe, au cours de laquelle des échantillons des laboratoires communautaires du sud de Wellington (WSCL) seraient transmis à l'Institut des sciences et de la recherche environnementales (ESR) pour des tests mNGS. ESR possède une expertise existante dans le séquençage et la bioinformatique et a déjà développé une capacité mNGS, mais ne l'a pas évaluée de manière exhaustive sur de vrais échantillons de patients. L'évaluation initiale aurait lieu à l'ESR, dans le but de produire un flux de travail qui pourrait être utilisable au WSCL.

Sélection de l'échantillon et renvoi du WSCL à l'ESR

1. Les échantillons résiduels qui ont été prélevés dans le cadre des soins de routine aux patients et envoyés au laboratoire de microbiologie du WSCL à des fins de diagnostic d'infection seront utilisés. C'est une pratique courante acceptée dans le laboratoire que le microbiologiste organise des tests supplémentaires (non demandés) sur certains échantillons cliniques pour optimiser le processus de diagnostic, y compris le transfert d'échantillons à un laboratoire externe tel que ESR. Cette évaluation suivrait une procédure similaire.
2. Les échantillons seront identifiés au WSCL par le(s) microbiologiste(s) clinique(s) impliqué(s) dans le projet. Divers types d'échantillons seront évalués. Les types d'échantillons spécifiques qui seront évalués lors de l'évaluation varieront au cours de l'évaluation, en fonction du bon fonctionnement du flux de travail mNGS sur différents types d'échantillons. Au départ, des échantillons provenant de sites normalement stériles et de ceux ayant potentiellement le plus grand impact positif sur les soins aux patients seront choisis (par ex. liquide céphalo-rachidien, liquide articulaire, liquide pleural, sang) suivi d'échantillons provenant de sites non stériles (par ex. crachats, urines, sécrétions de la plaie) si les premiers résultats sont encourageants.
3. WSCL traite des échantillons microbiologiques pour l'ensemble des régions du DHB Capital & Coast et Hutt Valley, de sorte que les échantillons proviendraient de patients de ces régions. La majorité des échantillons proviendront de patients hospitalisés, plutôt que de la communauté. Des échantillons provenant d'une variété de spécialités cliniques différentes seront évalués, y compris des unités de soins augmentés, par ex. les unités de soins intensifs adultes et néonatals et les patients du service général.

Taille de l'échantillon 1. Une taille d'échantillon spécifique n'a pas été calculée pour cette évaluation, car le nombre total d'échantillons testés dépendra du niveau de raffinement du processus de test mNGS requis, et l'évaluation devra probablement être un processus continu. Les enquêteurs ont fixé une taille d'échantillon maximale à 400.

Méthodologie mNGS

1. Les échantillons cliniques seront traités pour enrichir les cellules bactériennes à l'aide de billes magnétiques d'immobilisation réversible en phase solide (SPRI) fonctionnalisées avec de la poly-lysine. L'ADN de l'hôte (humain) sera appauvri à l'aide d'une lyse différentielle et d'un traitement à la nucléase.
2. L'acide nucléique total sera extrait des échantillons traités à l'aide de kits d'extraction d'ADN disponibles dans le commerce.
3. Le kit de séquençage rapide ONT sera utilisé pour séquencer l'ADN résultant.
4. Pour identifier les espèces pathogènes potentielles dans l'échantillon, toutes les séquences non humaines générées seront classées taxonomiquement au niveau de l'espèce à l'aide d'un algorithme de cartographie approximative basé sur un minimiseur rapide par rapport à des bases de données personnalisées sur les pathogènes.

Évitement du séquençage du génome de l'hôte (humain) Des processus robustes impliquant plusieurs stratégies publiées différentes seront mis en place pour éviter la possibilité d'un séquençage du génome humain par inadvertance.

1. Réduction de l'ADN de l'hôte dans l'échantillon :

   un. L'enrichissement des cellules bactériennes et l'épuisement chimique de l'ADN hôte au cours de la phase initiale de traitement de l'échantillon du protocole seront la première ligne pour éviter le séquençage de l'ADN humain en réduisant la quantité d'ADN hôte dans l'échantillon.

2. Éjecter l'ADN hôte du séquenceur :

   un. Le deuxième filtre pour réduire le séquençage de l'hôte sera l'utilisation de l'API 'Read Until' de l'ONT. Ce processus empêche automatiquement les séquences d'ADN préspécifiées d'entrer dans le détecteur en inversant le sens de déplacement de la molécule à travers le détecteur en moins d'une seconde, empêchant le séquençage de toute molécule hôte complète. Compte tenu du taux d'erreur brut des données de séquence, toute lecture courte de l'hôte qui passe ce filtre contient des informations insuffisantes pour être analysées.

3. Suppression de séquences hôtes :

   un. La dernière étape pour éviter d'exposer la séquence hôte à l'analyse consiste à supprimer automatiquement et définitivement toutes les données de séquence humaine résiduelles au fur et à mesure de leur production, avant que le flux de données n'entre dans l'étape d'analyse.

4. Mappage des séquences uniquement par rapport aux bases de données microbiennes :

   1. Dans le cas très improbable où la séquence hôte passe les étapes ci-dessus, une autre étape de sécurité est que toutes les séquences ne seront cartographiées que par rapport aux bases de données microbiennes. Cela signifie que toute séquence humaine ne créerait pas de correspondance et ne ferait donc pas partie de l'analyse.

Communication des résultats

1. Les résultats seront communiqués par ESR directement à WSCL via les mêmes voies sécurisées utilisées pour les autres tests de référence qu'ESR effectue pour WSCL.
2. Les résultats seront examinés par le(s) microbiologiste(s) clinique(s) impliqué(s) dans le projet afin qu'une évaluation de leur pertinence clinique puisse être faite avant que les résultats ne soient mis à la disposition des équipes cliniques.
3. Les résultats seront saisis dans le système d'information du laboratoire WSCL afin qu'ils puissent être communiqués à l'équipe clinique. Un commentaire sera joint au rapport textuel expliquant que les résultats ont été générés à l'aide de mNGS, qui est toujours en cours d'évaluation, et le microbiologiste discutera directement avec l'équipe clinique des résultats s'il existe un potentiel d'incertitude entourant le résultat.

Évaluation des résultats

1. Les résultats des tests mNGS parallèles seront comparés au fil du temps aux résultats produits par des tests de laboratoire de routine sur le même échantillon, afin d'évaluer la sensibilité, la spécificité et le niveau d'accord entre les méthodes. Étant donné que le mNGS est potentiellement plus sensible que les méthodes de routine, les résultats du mNGS seront également évalués par le(s) microbiologiste(s) clinique(s) impliqué(s) dans le projet par rapport à d'autres tests de diagnostic de routine (orthogonaux), qui pourraient inclure d'autres tests de laboratoire, la radiologie et l'ensemble des tests cliniques. évaluation du patient.
2. L'impact clinique du test mNGS sera également évalué et enregistré : pour chaque résultat mNGS, le ou les microbiologistes cliniques évalueront l'impact clinique du résultat mNGS sur l'évaluation globale et la prise en charge du patient.