Valutazione di un flusso di lavoro mNGS per la diagnosi di infezione utilizzando il sequenziamento di Oxford Nanopore.

La microbiologia diagnostica ha tradizionalmente coinvolto la coltura di organismi per diagnosticare l'infezione, che richiede tempo, è insensibile per organismi difficili da coltivare e compromessa da una precedente terapia antimicrobica. Diagnostica molecolare, prevalentemente sotto forma di test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT), ad es. PCR, superano alcune di queste limitazioni e sono ora in uso diffuso e crescente. I test basati su NAAT sono tuttavia limitati dal fatto di essere in grado di rilevare solo un piccolo numero di organismi pre-specificati e possono offrire informazioni limitate o assenti sulla sensibilità antimicrobica.

Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) funziona sequenziando direttamente tutto l'acido nucleico in un campione microbiologico, consentendo così l'identificazione di tutti i microrganismi presenti in quantità sufficiente, insieme alla possibilità di dedurre modelli di suscettibilità antimicrobica basati sulla presenza o assenza di geni rilevanti. A differenza del NAAT, non è richiesta alcuna pre-specificazione dei patogeni bersaglio, quindi mNGS ha il potenziale per identificare agenti patogeni importanti che potrebbero non essere stati testati in altro modo. Anche le sequenze host (umane) saranno presenti nel campione, quindi vengono rimosse dall'analisi impedendo loro di essere sequenziate o eliminandole durante le fasi iniziali dell'analisi.

mNGS ha quindi la capacità di superare i limiti della diagnosi di infezione basata su coltura e NAAT, con il potenziale per offrire una diagnostica rapida con maggiori livelli di dettaglio della suscettibilità antimicrobica, che è meno influenzata dal fatto che l'organismo sia vitale/coltivabile. La diagnostica rapida delle infezioni ha la capacità di migliorare significativamente la cura del paziente, per cui una terapia antimicrobica adeguatamente mirata può essere istituita tempestivamente (o interrotta se ad esempio viene identificato un agente patogeno virale). Ciò è di particolare importanza dato il continuo aumento globale della resistenza antimicrobica. La diagnostica rapida con mNGS può anche ridurre la necessità di molteplici altre linee di indagine. È probabile che ci siano alcuni gruppi di pazienti in cui questa tecnologia può essere particolarmente mirata per il massimo beneficio, sia per la rapidità dei risultati che per la capacità di diagnosticare infezioni che potrebbero non essere state clinicamente sospettate o rilevate con processi standard. Nel dipartimento degli investigatori, recentemente sono stati osservati diversi casi in cui i pazienti hanno avuto esiti molto scarsi a causa di ritardi nella diagnosi, dove mNGS avrebbe avuto il potenziale per migliorare notevolmente i loro risultati. Ci sono anche potenziali benefici a livello di popolazione, come la riduzione dell'esposizione della popolazione ad antibiotici ad ampio spettro, la rapida identificazione e sorveglianza delle malattie trasmissibili che possono richiedere una risposta di sanità pubblica e l'accelerazione della gestione e del flusso di pazienti adeguati attraverso un già sistema ospedaliero congestionato. mNGS ha anche la capacità di rilevare nuovi agenti patogeni. Ad esempio, la rapida identificazione e diffusione delle informazioni relative a SARS-CoV-2 è stata dovuta alla disponibilità di tecnologie di sequenziamento rapido "agnostico".

Il sequenziamento di nuova generazione è stato in genere troppo costoso per essere utilizzato come test diagnostico di prima linea, con il suo uso limitato a istituzioni affiliate alla ricerca più grandi. Tuttavia, il sequenziamento dei nanopori (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) offre ora un'opzione relativamente poco costosa, con un ingombro fisico ridotto e la capacità di generare rapidamente una grande quantità di dati di sequenza, rendendola un'opzione potenzialmente praticabile per la microbiologia diagnostica di prima linea laboratori. Pertanto, vi è un notevole interesse nell'uso del sequenziamento dei nanopori per mNGS. Numerose pubblicazioni hanno riferito del suo utilizzo nella diagnostica clinica ed è già in uso in una serie di strutture sanitarie all'estero

. Il miglioramento continuo della qualità (QI) attraverso la valutazione di nuovi test diagnostici è una componente di fondamentale importanza della medicina clinica di laboratorio. In linea con questo, i ricercatori sono interessati a valutare l'uso di mNGS nel loro laboratorio come iniziativa di QI per migliorare il servizio diagnostico, aumentare la sensibilità dei test diagnostici delle infezioni e confrontare le procedure diagnostiche standard esistenti con mNGS. Gli investigatori hanno in programma di intraprendere questo sotto forma di una valutazione esterna, in base alla quale i campioni dei Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) sarebbero stati inoltrati all'Institute of Environmental Sciences and Research (ESR) per i test mNGS. L'ESR dispone di competenze esistenti nel sequenziamento e nella bioinformatica e ha già sviluppato la capacità di mNGS, tuttavia non l'ha valutata in modo completo su campioni di pazienti reali. La valutazione iniziale avverrebbe presso ESR, con l'obiettivo di produrre un flusso di lavoro che possa essere utilizzato presso WSCL.

Selezione del campione e rinvio da WSCL a ESR

1. Verranno utilizzati i campioni residui che sono stati raccolti nell'ambito della normale cura del paziente e inviati al laboratorio di microbiologia del WSCL ai fini della diagnosi dell'infezione. È pratica standard accettata in laboratorio che il microbiologo organizzi test aggiuntivi (non richiesti) su determinati campioni clinici per ottimizzare il processo diagnostico, incluso il rinvio dei campioni a un laboratorio esterno come ESR. Questa valutazione seguirebbe una procedura simile.
2. I campioni saranno identificati al WSCL dal/i microbiologo/i clinico/i coinvolto/i nel progetto. Verranno valutati diversi tipi di campioni. I tipi di campioni specifici che verranno valutati nella valutazione varieranno durante il corso della valutazione, in base al modo in cui il flusso di lavoro mNGS funziona su diversi tipi di campioni. Inizialmente verranno scelti campioni provenienti da siti normalmente sterili e da quelli con il potenziale maggiore impatto positivo sulla cura del paziente (ad es. liquido cerebrospinale, liquido articolare, liquido pleurico, sangue) seguiti da campioni prelevati da siti non sterili (ad es. espettorato, urina, fluidi della ferita) se i risultati iniziali sono incoraggianti.
3. WSCL elabora campioni microbiologici per l'intera regione Capital & Coast e Hutt Valley DHB, quindi i campioni verrebbero prelevati da pazienti in queste regioni. La maggior parte dei campioni proverrà da pazienti ospedalizzati, piuttosto che da comunità. Saranno valutati campioni provenienti da una varietà di diverse specialità cliniche, comprese le unità di cura aumentata, ad es. unità di terapia intensiva sia per adulti che neonatali e pazienti del reparto generale.

Dimensione del campione 1. Non è stata calcolata una dimensione specifica del campione per questa valutazione, poiché il numero totale di campioni testati dipenderà dalla quantità di perfezionamento del processo di test mNGS richiesto ed è probabile che la valutazione debba essere un processo continuo. Gli investigatori hanno fissato una dimensione massima del campione a 400.

Metodologia mNGS

1. I campioni clinici saranno processati per l'arricchimento di cellule batteriche utilizzando biglie magnetiche di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) funzionalizzate con poli-lisina. Il DNA dell'ospite (umano) sarà depletato mediante lisi differenziale e trattamento con nucleasi.
2. L'acido nucleico totale sarà estratto dai campioni processati utilizzando kit di estrazione del DNA disponibili in commercio.
3. Il kit di sequenziamento rapido ONT verrà utilizzato per sequenziare il DNA risultante.
4. Per identificare potenziali specie patogene nel campione, tutte le sequenze non umane generate saranno classificate tassonomicamente a livello di specie utilizzando un algoritmo di mappatura approssimata basato su minimizzatore veloce contro database di patogeni personalizzati.

Prevenzione del sequenziamento del genoma dell'ospite (umano) Saranno messi in atto processi robusti che coinvolgono diverse strategie pubblicate diverse per evitare la possibilità di un sequenziamento involontario del genoma umano.

1. Riduzione del DNA dell'ospite nel campione:

   UN. L'arricchimento delle cellule batteriche e l'esaurimento chimico del DNA ospite durante la fase iniziale di elaborazione del campione del protocollo saranno la prima linea per evitare il sequenziamento del DNA umano riducendo la quantità di DNA ospite nel campione.

2. Espulsione del DNA dell'ospite dal sequenziatore:

   UN. Il secondo filtro per ridurre la sequenza dell'host utilizzerà l'API ONT 'Read Until'. Questo processo impedisce automaticamente l'ingresso nel rivelatore di sequenze di DNA prespecificate, invertendo la direzione di spostamento della molecola attraverso il rivelatore in meno di un secondo, impedendo il sequenziamento di qualsiasi molecola ospite a lunghezza intera. Dato il tasso di errore non elaborato dei dati della sequenza, qualsiasi breve lettura dell'host che passa questo filtro contiene informazioni insufficienti per essere analizzate.

3. Eliminazione di sequenze host:

   UN. Il passaggio finale per evitare di esporre la sequenza host all'analisi è l'eliminazione automatica e permanente di tutti i dati residui della sequenza umana man mano che vengono prodotti, prima che il flusso di dati entri nella fase di analisi.

4. Sequenze di mappatura solo su database microbici:

   1. Nel caso molto improbabile che la sequenza dell'ospite superi i passaggi precedenti, un ulteriore passaggio di sicurezza è che qualsiasi sequenza verrà mappata solo rispetto ai database microbici. Ciò significa che qualsiasi sequenza umana non creerebbe una corrispondenza, quindi non farebbe parte dell'analisi.

Rendicontazione dei risultati

1. I risultati saranno riportati da ESR direttamente a WSCL tramite gli stessi percorsi sicuri utilizzati per altri test di riferimento che ESR esegue per WSCL.
2. I risultati saranno esaminati dal/i microbiologo/i clinico/i coinvolto/i nel progetto in modo che possa essere effettuata una valutazione della loro rilevanza clinica prima che i risultati siano messi a disposizione dei team clinici.
3. I risultati verranno inseriti nel sistema informativo di laboratorio WSCL in modo che possano essere riportati al team clinico. Al rapporto di testo verrà allegato un commento che spieghi che i risultati sono stati generati utilizzando mNGS, che è ancora in fase di valutazione, e il microbiologo discuterà direttamente con il team clinico in merito ai risultati se esiste un potenziale di incertezza che circonda il risultato.

Valutazione dei risultati

1. I risultati del test mNGS parallelo saranno confrontati nel tempo con i risultati prodotti da test di laboratorio di routine sullo stesso campione, per valutare la sensibilità, la specificità e il livello di accordo tra i metodi. Dato che mNGS è potenzialmente più sensibile dei metodi di routine, i risultati di mNGS saranno valutati anche dal/i microbiologo/i clinico/i coinvolto/i nel progetto rispetto ad altri test diagnostici di routine (ortogonali), che potrebbero includere altri test di laboratorio, radiologia e il quadro clinico generale valutazione del paziente.
2. Verrà inoltre valutato e registrato l'impatto clinico del test mNGS: per ogni risultato mNGS il/i microbiologo/i clinico/i effettuerà una valutazione dell'impatto clinico che il risultato mNGS ha avuto sulla valutazione complessiva e sulla gestione del paziente.