Evaluering af en mNGS-arbejdsgang til infektionsdiagnose ved hjælp af Oxford Nanopore-sekventering.

Diagnostisk mikrobiologi har traditionelt involveret dyrkning af organismer for at diagnosticere infektion, hvilket er tidskrævende, ufølsomt for organismer, der er vanskelige at dyrke, og kompromitteret af tidligere antimikrobiel terapi. Molekylær diagnostik, overvejende i form af nukleinsyreamplifikationstest (NAAT), f.eks. PCR, overvinder nogle af disse begrænsninger og er nu i udbredt og stigende brug. NAAT-baserede tests er dog begrænset af kun at være i stand til at påvise et lille antal præspecificerede organismer og kan tilbyde begrænset til ingen antimikrobiel modtagelighedsinformation.

Metagenomisk næste generations sekventering (mNGS) virker ved direkte at sekventere al nukleinsyren i en mikrobiologisk prøve, hvilket muliggør identifikation af alle mikroorganismer, der er til stede i tilstrækkelig mængde, sammen med potentialet til at udlede antimikrobielle modtagelighedsmønstre baseret på tilstedeværelse eller fravær af relevante gener. I modsætning til NAAT kræves ingen præ-specifikation af målpatogen(er), så mNGS har potentialet til at identificere vigtige patogener, som måske ikke er blevet testet for ellers. Værts (menneskelige) sekvenser vil også være til stede i prøven, så de fjernes fra analysen enten ved at forhindre dem i at blive sekventeret eller slette dem under de indledende analysetrin.

mNGS har derfor evnen til at overvinde begrænsningerne ved både kulturbaseret og NAAT-baseret infektionsdiagnostik, med potentiale til at tilbyde hurtig diagnostik med større niveauer af antimikrobiel modtagelighedsdetaljer, som er mindre påvirket af, om organismen er levedygtig/dyrkbar. Hurtig infektionsdiagnostik har evnen til at forbedre patientbehandlingen væsentligt, hvorved passende målrettet antimikrobiel behandling kan iværksættes omgående (eller ophøre, hvis f.eks. et viralt patogen identificeres). Dette er af særlig betydning i betragtning af den igangværende globale stigning i antimikrobiel resistens. Hurtig diagnostik med mNGS kan også reducere behovet for flere andre undersøgelseslinjer. Der vil sandsynligvis være visse grupper af patienter, hvor denne teknologi kan være særligt målrettet for maksimal fordel enten på grund af resultaternes hurtighed eller evnen til at diagnosticere infektioner, som måske ikke er klinisk mistænkt eller opdaget med standardprocesser. I efterforskernes afdeling er der på det seneste set flere tilfælde, hvor patienter har haft meget dårlige udfald på grund af forsinkelser i diagnosticering, hvor mNGS ville have haft potentiale til at forbedre deres udfald markant. Der er også potentielle fordele på befolkningsniveau, såsom at reducere befolkningens eksponering for alt for bredspektrede antibiotika, hurtig identifikation og overvågning af overførbare sygdomme, der kan kræve en folkesundhedsreaktion, og fremskynde passende håndtering og flow af patienter gennem en allerede overbelastede sygehusvæsen. mNGS har også evnen til at opdage nye patogener. Som et eksempel skyldtes den hurtige identifikation og spredning af information vedrørende SARS-CoV-2 tilgængeligheden af ​​hurtige 'agnostiske' sekventeringsteknologier.

Næste generations sekventering har typisk været for dyr til at blive brugt som en frontlinjediagnostisk test, hvor brugen er begrænset til større forskningstilknyttede institutioner. Imidlertid tilbyder nanopore-sekventering (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) nu en relativt billig mulighed med et lille fysisk fodaftryk og en evne til hurtigt at generere en stor mængde sekvensdata, hvilket gør det til en potentielt levedygtig mulighed for diagnostisk mikrobiologi i frontlinjen. laboratorier. Som sådan er der betydelig interesse i brugen af ​​nanopore-sekventering til mNGS. En række publikationer har rapporteret om dets anvendelse i klinisk diagnostik, og det er allerede i brug i en række sundhedsmiljøer i udlandet

. Kontinuerlig kvalitetsforbedring (QI) via evaluering af nye diagnostiske assays er en kritisk vigtig komponent i klinisk laboratoriemedicin. I tråd med dette er efterforskerne interesserede i at evaluere brugen af ​​mNGS i deres laboratorium som et QI-initiativ for at forbedre den diagnostiske service, øge følsomheden af ​​infektionsdiagnostisk testning og sammenligne eksisterende standarddiagnostiske procedurer med mNGS. Efterforskerne planlægger at påtage sig dette i form af en ekstern evaluering, hvorved prøver fra Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) vil blive sendt til Institute of Environmental Sciences and Research (ESR) til mNGS-testning. ESR har eksisterende ekspertise inden for sekventering og bioinformatik og har allerede udviklet mNGS-kapacitet, men har ikke evalueret det grundigt på rigtige patientprøver. Den indledende evaluering ville finde sted på ESR med det formål at producere en arbejdsgang, der kunne bruges på WSCL.

Prøveudvælgelse og henvisning fra WSCL til ESR

1. Restprøver, der er blevet indsamlet som en del af rutinemæssig patientbehandling og sendt til WSCLs mikrobiologiske laboratorium med det formål at diagnosticere infektion, vil blive brugt. Det er standard accepteret praksis i laboratoriet, at mikrobiologen arrangerer yderligere (uønsket) test på visse kliniske prøver for at optimere den diagnostiske proces, herunder henvisning af prøver til et eksternt laboratorium, såsom ESR. Denne evaluering ville følge en lignende procedure.
2. Prøver vil blive identificeret på WSCL af den eller de kliniske mikrobiologer, der er involveret i projektet. En række prøvetyper vil blive evalueret. De specifikke prøvetyper, der vil blive vurderet i evalueringen, vil variere i løbet af evalueringen, baseret på hvor godt mNGS-workflowet fungerer på forskellige prøvetyper. Indledningsvis vil der blive valgt prøver fra normalt sterile steder og dem med potentielt den største positive indvirkning på patientbehandlingen (f. cerebrospinalvæske, ledvæske, pleuravæske, blod) efterfulgt af prøver fra ikke-sterile steder (f.eks. sputum, urin, sårvæsker), hvis de første resultater er opmuntrende.
3. WSCL behandler mikrobiologiske prøver for hele Capital & Coast og Hutt Valley DHB-regionerne, så prøver ville blive hentet fra patienter i disse regioner. Størstedelen af ​​prøverne vil være fra indlagte patienter i stedet for lokalsamfundsbaserede. Prøver fra en række forskellige kliniske specialer vil blive evalueret, herunder augmented care units, f.eks. både voksen- og neonatale intensivafdelinger og almene afdelingspatienter.

Prøvestørrelse 1. En specifik stikprøvestørrelse er ikke blevet beregnet for denne evaluering, da det samlede antal testede prøver vil være afhængig af, hvor meget raffinement af mNGS-testprocessen, der kræves, og evalueringen sandsynligvis skal være en løbende proces. Efterforskerne har sat en maksimal stikprøvestørrelse på 400.

mNGS metode

1. Kliniske prøver vil blive behandlet for at berige bakterieceller ved hjælp af fastfase reversibel immobilisering (SPRI) magnetiske perler funktionaliserede med polylysin. Værts (humant) DNA vil blive udtømt ved hjælp af differentiel lysis og nukleasebehandling.
2. Total nukleinsyre vil blive ekstraheret fra de behandlede prøver ved hjælp af kommercielt tilgængelige DNA-ekstraktionssæt.
3. ONT hurtig sekventeringskit vil blive brugt til at sekventere det resulterende DNA.
4. For at identificere potentielle patogenarter i prøven vil alle genererede ikke-menneskelige sekvenser blive taksonomisk klassificeret til artsniveau ved hjælp af en hurtig minimiser-baseret omtrentlig kortlægningsalgoritme mod tilpassede patogendatabaser.

Undgåelse af sekvensering af værtsgenom (humant) Robuste processer, der involverer flere forskellige offentliggjorte strategier, vil blive iværksat for at undgå muligheden for utilsigtet sekventering af humant genom.

1. Reducerende værts-DNA i prøven:

   en. Bakteriecelleberigelse og kemisk udtømning af værts-DNA under den indledende prøvebehandlingsfase af protokollen vil være den første linje i at undgå sekventering af humant DNA ved at reducere mængden af ​​værts-DNA i prøven.

2. Udstødning af værts-DNA fra sekvenseren:

   en. Det andet filter til at reducere værtssekventering vil bruge ONT 'Read Until' API. Denne proces forhindrer automatisk forudbestemte DNA-sekvenser i at komme ind i detektoren ved at vende molekylets rejseretning gennem detektoren inden for mindre end et sekund, hvilket forhindrer, at alle værtsmolekyler i fuld længde bliver sekventeret. I betragtning af den rå fejlrate for sekvensdataene, har enhver kort værtslæsning, der passerer dette filter, utilstrækkelig information til at blive analyseret.

3. Sletning af værtssekvenser:

   en. Det sidste trin for at undgå at udsætte værtssekvens for analyse er automatisk og permanent sletning af eventuelle resterende humane sekvensdata, efterhånden som de produceres, før datastrømmen går ind i analysetrinnet.

4. Kortlægning af sekvenser kun mod mikrobielle databaser:

   1. I det meget usandsynlige tilfælde, at værtssekvensen passerer ovenstående trin, er et yderligere sikkerhedstrin, at eventuelle sekvenser kun vil blive kortlagt mod mikrobielle databaser. Dette betyder, at nogen menneskelige sekvenser ikke ville skabe et match, så de ville ikke indgå i analysen.

Indberetning af resultater

1. Resultater vil blive rapporteret af ESR direkte til WSCL via de samme sikre veje, der bruges til anden referencetest, som ESR udfører for WSCL.
2. Resultaterne vil blive gennemgået af den eller de kliniske mikrobiologer, der er involveret i projektet, således at en vurdering af deres kliniske relevans kan foretages, før resultaterne stilles til rådighed for kliniske teams.
3. Resultater vil blive indtastet i WSCL laboratorieinformationssystemet, så de kan rapporteres til det kliniske team. Der vil blive knyttet en kommentar til tekstrapporten, der forklarer, at resultaterne er genereret ved hjælp af mNGS, som stadig evalueres, og mikrobiologen vil diskutere direkte med det kliniske team vedrørende resultaterne, hvis der er potentiale for usikkerhed omkring resultatet.

Evaluering af resultater

1. Resultaterne af den parallelle mNGS-test vil blive sammenlignet over tid med resultaterne produceret ved rutinemæssig laboratorietestning på den samme prøve for at vurdere sensitiviteten, specificiteten og niveauet af overensstemmelse mellem metoderne. Da mNGS potentielt er mere følsomt end rutinemetoder, vil mNGS-resultater også blive vurderet af den eller de kliniske mikrobiologer, der er involveret i projektet i forhold til anden rutinemæssig diagnostisk (ortogonal) test, som kunne omfatte andre laboratorietests, radiologi og den overordnede kliniske vurdering af patienten.
2. Den kliniske effekt af mNGS-testningen vil også blive vurderet og registreret: For hvert mNGS-resultat vil den eller de kliniske mikrobiologer foretage en vurdering af den kliniske indvirkning mNGS-resultatet havde på den overordnede vurdering og håndtering af patienten.