Utvärdering av ett mNGS-arbetsflöde för infektionsdiagnos med hjälp av Oxford Nanopore-sekvensering.

Diagnostisk mikrobiologi har traditionellt involverat odling av organismer för att diagnostisera infektion, vilket är tidskrävande, okänsligt för organismer som är svåra att odla och äventyras av tidigare antimikrobiell terapi. Molekylär diagnostik, övervägande i form av nukleinsyraamplifieringstester (NAAT), t.ex. PCR, övervinner några av dessa begränsningar och är nu i utbredd och ökande användning. NAAT-baserade tester begränsas dock av att endast kunna detektera ett litet antal förspecificerade organismer och kan erbjuda begränsad till ingen information om antimikrobiell känslighet.

Metagenomisk nästa generations sekvensering (mNGS) fungerar genom att direkt sekvensera all nukleinsyra i ett mikrobiologiskt prov, vilket möjliggör identifiering av alla mikroorganismer som finns närvarande i tillräcklig mängd, tillsammans med potentialen att härleda antimikrobiella känslighetsmönster baserat på närvaro eller frånvaro av relevanta gener. Till skillnad från NAAT krävs ingen förspecifikation av målpatogen(er), så mNGS har potential att identifiera viktiga patogener som kanske inte har testats för annars. Värdsekvenser (mänskliga) kommer också att finnas i provet, så de tas bort från analysen antingen genom att förhindra dem från att sekvenseras eller radera dem under de första analysstegen.

mNGS har därför förmågan att övervinna begränsningarna för både kulturbaserad och NAAT-baserad infektionsdiagnostik, med potential att erbjuda snabb diagnostik med högre nivåer av antimikrobiell mottaglighetsdetaljer, som påverkas mindre av om organismen är livsduglig/odlingsbar. Snabb infektionsdiagnostik har förmågan att avsevärt förbättra patientvården, varigenom lämpligt riktad antimikrobiell terapi kan sättas in omgående (eller upphöra om t.ex. en viral patogen identifieras). Detta är särskilt viktigt med tanke på den pågående globala ökningen av antimikrobiell resistens. Snabb diagnostik med mNGS kan också minska behovet av flera andra undersökningslinjer. Det kommer sannolikt att finnas vissa grupper av patienter där denna teknologi kan riktas särskilt mot för maximal nytta, antingen på grund av resultatens snabbhet eller förmågan att diagnostisera infektioner som kanske inte har varit kliniskt misstänkta eller upptäckts med standardprocesser. På utredarnas avdelning har flera fall setts nyligen där patienter har haft mycket dåliga resultat på grund av förseningar i diagnos, där mNGS skulle ha haft potential att markant förbättra sina resultat. Det finns också potentiella fördelar på befolkningsnivå, såsom att minska befolkningens exponering för alltför bredspektrumantibiotika, snabb identifiering och övervakning av smittsamma sjukdomar som kan kräva ett folkhälsosvar och påskynda lämplig hantering och flöde av patienter genom en redan överbelastat sjukhussystem. mNGS har också förmågan att upptäcka nya patogener. Som ett exempel berodde den snabba identifieringen och spridningen av information om SARS-CoV-2 på tillgången till snabb "agnostisk" sekvenseringsteknik.

Nästa generations sekvensering har vanligtvis varit för dyrt för att användas som ett diagnostiskt test i frontlinjen, med användningen begränsad till större forskningsanslutna institutioner. Men nanopore-sekvensering (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) erbjuder nu ett relativt billigt alternativ, med ett litet fysiskt fotavtryck och en förmåga att snabbt generera en stor mängd sekvensdata, vilket gör det till ett potentiellt genomförbart alternativ för diagnostisk mikrobiologi i frontlinjen. laboratorier. Som sådan finns det ett stort intresse för användningen av nanopore-sekvensering för mNGS. Ett antal publikationer har rapporterat om dess användning i klinisk diagnostik, och den används redan i ett antal hälsovårdsmiljöer utomlands

. Kontinuerlig kvalitetsförbättring (QI) via utvärdering av nya diagnostiska analyser är en mycket viktig komponent i klinisk laboratoriemedicin. I linje med detta är utredarna intresserade av att utvärdera användningen av mNGS i deras laboratorium som ett QI-initiativ för att förbättra den diagnostiska tjänsten, öka känsligheten för infektionsdiagnostiska tester och jämföra befintliga standarddiagnostiska procedurer mot mNGS. Utredarna planerar att genomföra detta i form av en extern utvärdering, varvid prover från Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) skulle skickas till Institutet för miljövetenskap och forskning (ESR) för mNGS-testning. ESR har existerande expertis inom sekvensering och bioinformatik och har redan utvecklat mNGS-kapacitet, men har inte utvärderat den heltäckande på riktiga patientprover. Den initiala utvärderingen skulle ske vid ESR, med syftet att ta fram ett arbetsflöde som skulle kunna användas vid WSCL.

Provurval och remiss från WSCL till ESR

1. Restprover som har samlats in som en del av rutinmässig patientvård och skickats till WSCLs mikrobiologiska laboratorium i syfte att diagnostisera infektion kommer att användas. Det är standard praxis i laboratoriet för mikrobiologen att arrangera ytterligare (obegärda) tester på vissa kliniska prover för att optimera den diagnostiska processen, inklusive remiss av prover till ett externt laboratorium såsom ESR. Denna utvärdering skulle följa ett liknande förfarande.
2. Prover kommer att identifieras vid WSCL av den eller de kliniska mikrobiologer som är involverade i projektet. En mängd olika provtyper kommer att utvärderas. De specifika provtyper som kommer att bedömas i utvärderingen kommer att variera under utvärderingens gång, baserat på hur väl mNGS-arbetsflödet fungerar på olika provtyper. Initialt kommer prover från normalt sterila platser och de med potentiellt störst positiv inverkan på patientvården att väljas (t.ex. cerebrospinalvätska, ledvätska, pleuravätska, blod) följt av prover från icke-sterila platser (t.ex. sputum, urin, sårvätskor) om de första resultaten är uppmuntrande.
3. WSCL bearbetar mikrobiologiska prover för hela Capital & Coast och Hutt Valley DHB-regionerna, så prover kommer att hämtas från patienter i dessa regioner. Majoriteten av proverna kommer att vara från inlagda patienter, snarare än gemenskapsbaserade. Prover från en mängd olika kliniska specialiteter kommer att utvärderas, inklusive augmented care-enheter t.ex. både vuxen- och neonatalintensivvårdsavdelningar och allmänna avdelningspatienter.

Provstorlek 1. En specifik provstorlek har inte beräknats för denna utvärdering, eftersom det totala antalet prover som testas kommer att vara beroende av hur mycket förfining av mNGS-testprocessen som krävs, och utvärderingen kommer sannolikt att behöva vara en pågående process. Utredarna har satt en maximal urvalsstorlek på 400.

mNGS metodik

1. Kliniska prover kommer att bearbetas för att berika bakterieceller med hjälp av magnetiska pärlor med reversibel immobilisering i fast fas (SPRI) funktionaliserade med polylysin. Värd (humant) DNA kommer att utarmas med hjälp av differentiell lysis och nukleasbehandling.
2. Total nukleinsyra kommer att extraheras från de bearbetade proverna med hjälp av kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionssatser.
3. ONT snabbsekvenseringskit kommer att användas för att sekvensera det resulterande DNA:t.
4. För att identifiera potentiella patogenarter i provet kommer alla genererade icke-mänskliga sekvenser att klassificeras taxonomiskt till artnivå med hjälp av en snabb minimerbaserad ungefärlig kartläggningsalgoritm mot anpassade patogendatabaser.

Undvikande av värdgenomsekvensering Robusta processer som involverar flera olika publicerade strategier kommer att införas för att undvika risken för oavsiktlig sekvensering av mänskligt genom.

1. Reducerande värd-DNA i provet:

   a. Bakteriecellsanrikning och kemisk utarmning av värd-DNA under det inledande provbearbetningsskedet av protokollet kommer att vara den första linjen för att undvika sekvensering av mänskligt DNA genom att minska mängden värd-DNA i provet.

2. Matar ut värd-DNA från sekvenseraren:

   a. Det andra filtret för att minska värdsekvenseringen kommer att använda ONT 'Read Until' API. Denna process förhindrar automatiskt fördefinierade DNA-sekvenser från att komma in i detektorn genom att vända molekylens färdriktning genom detektorn inom mindre än en sekund, vilket förhindrar att alla värdmolekyler i full längd sekvenseras. Med tanke på den råa felfrekvensen för sekvensdata, innehåller alla korta värdläsningar som passerar detta filter otillräcklig information för att kunna analyseras.

3. Ta bort värdsekvenser:

   a. Det sista steget för att undvika att exponera värdsekvensen för analys är att automatiskt och permanent radera eventuella återstående mänskliga sekvensdata när de produceras, innan dataströmmen går in i analyssteget.

4. Kartläggning av sekvenser endast mot mikrobiella databaser:

   1. I den mycket osannolika händelsen att värdsekvensen klarar ovanstående steg, är ett ytterligare säkerhetssteg att eventuella sekvenser endast kommer att kartläggas mot mikrobiella databaser. Detta innebär att alla mänskliga sekvenser inte skulle skapa en matchning, så de skulle inte ingå i analysen.

Rapportering av resultat

1. Resultat kommer att rapporteras av ESR direkt till WSCL via samma säkra vägar som används för andra referenstestningar som ESR utför för WSCL.
2. Resultaten kommer att granskas av den eller de kliniska mikrobiologer som är involverade i projektet så att en bedömning av deras kliniska relevans kan göras innan resultaten görs tillgängliga för kliniska team.
3. Resultat kommer att föras in i WSCLs laboratorieinformationssystem så att de kan rapporteras till det kliniska teamet. En kommentar kommer att bifogas textrapporten som förklarar att resultaten har genererats med hjälp av mNGS, som fortfarande utvärderas, och mikrobiologen kommer att diskutera direkt med det kliniska teamet angående resultaten om det finns någon potential för osäkerhet kring resultatet.

Utvärdering av resultat

1. Resultaten av den parallella mNGS-testningen kommer att jämföras över tid med resultaten som produceras av rutinmässiga laboratorietester på samma prov, för att bedöma känsligheten, specificiteten och nivån av överensstämmelse mellan metoderna. Med tanke på att mNGS potentiellt är känsligare än rutinmetoder, kommer mNGS-resultat också att bedömas av den eller de kliniska mikrobiologer som är involverade i projektet mot andra rutindiagnostiska (ortogonala) tester, som kan inkludera andra laboratorietester, radiologi och den övergripande kliniska bedömning av patienten.
2. Den kliniska effekten av mNGS-testningen kommer också att bedömas och registreras: för varje mNGS-resultat kommer den eller de kliniska mikrobiologerna att göra en bedömning av den kliniska inverkan mNGS-resultatet hade på den övergripande bedömningen och behandlingen av patienten.