Oxford Nanopore Sequencing을 사용한 감염 진단을 위한 mNGS 워크플로 평가.

진단 미생물학은 전통적으로 감염을 진단하기 위해 유기체 배양을 포함하는데, 이는 시간이 많이 걸리고 성장하기 어려운 유기체에 둔감하며 이전의 항균 요법에 의해 손상되었습니다. 주로 핵산 증폭 검사(NAAT) 형태의 분자 진단, 예. PCR은 이러한 한계 중 일부를 극복하고 현재 널리 사용되고 있으며 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 NAAT 기반 테스트는 미리 지정된 소수의 유기체만 검출할 수 있다는 제한이 있으며 항균제 감수성 정보를 제한적으로 제공할 수 있습니다.

Metagenomic next generation sequencing(mNGS)은 미생물 샘플의 모든 핵산을 직접 시퀀싱하여 충분한 양으로 존재하는 모든 미생물을 식별할 수 있으며, 미생물의 존재 여부에 따라 항균제 감수성 패턴을 추론할 수 있습니다. 관련 유전자. NAAT와 달리 대상 병원체의 사전 사양이 필요하지 않으므로 mNGS는 다른 방법으로는 테스트되지 않았을 수 있는 중요한 병원체를 식별할 수 있는 잠재력이 있습니다. 호스트(인간) 시퀀스도 샘플에 존재하므로 시퀀스가 ​​지정되지 않도록 하거나 초기 분석 단계에서 삭제하여 분석에서 제거합니다.

따라서 mNGS는 배양 기반 및 NAAT 기반 감염 진단의 한계를 극복할 수 있는 능력이 있으며, 유기체가 생존/배양 가능한지 여부에 덜 영향을 받는 더 높은 수준의 항균 감수성 세부 정보로 신속한 진단을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신속한 감염 진단은 환자 치료를 크게 개선할 수 있는 능력이 있어 적절하게 표적화된 항균 요법을 즉시 시작할 수 있습니다(또는 예를 들어 바이러스 병원체가 확인된 경우 중단할 수 있음). 이는 항균제 내성이 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있다는 점에서 특히 중요합니다. mNGS를 사용한 신속한 진단은 또한 여러 다른 조사 라인의 필요성을 줄일 수 있습니다. 임상적으로 의심되거나 표준 프로세스로 감지되지 않을 수 있는 감염을 진단할 수 있는 능력 또는 결과의 신속성으로 인해 이 기술이 최대 이익을 위해 특히 표적이 될 수 있는 특정 환자 그룹이 있을 수 있습니다. 조사관 부서에서는 최근 mNGS가 결과를 현저하게 개선할 가능성이 있는 진단 지연으로 인해 환자의 결과가 매우 좋지 않은 여러 사례가 목격되었습니다. 또한 인구 수준에서 과도하게 광범위한 항생제에 대한 노출 감소, 공중 보건 대응이 필요할 수 있는 전염병의 신속한 식별 및 감시, 적절한 관리 및 환자 흐름 촉진과 같은 잠재적인 이점이 있습니다. 혼잡한 병원 시스템. mNGS는 또한 새로운 병원체를 탐지하는 능력을 가지고 있습니다. 예를 들어, SARS-CoV-2와 관련된 정보의 신속한 식별 및 전파는 신속한 '불가지' 시퀀싱 기술의 가용성 때문이었습니다.

차세대 시퀀싱은 일반적으로 일선 진단 테스트로 사용하기에는 너무 비싸고 대규모 연구 제휴 기관에 국한되어 사용되었습니다. 그러나 nanopore sequencing(Oxford Nanopore Technologies[ONT])은 이제 상대적으로 저렴한 옵션을 제공하며 작은 물리적 공간과 많은 양의 시퀀스 데이터를 신속하게 생성할 수 있는 기능을 제공하므로 일선 진단 미생물학에 잠재적으로 실행 가능한 옵션이 됩니다. 실험실. 이와 같이 mNGS에 대한 나노포어 시퀀싱의 사용에 상당한 관심이 있습니다. 많은 간행물에서 임상 진단에서의 사용에 대해 보고했으며 이미 해외 여러 의료 환경에서 사용되고 있습니다.

. 새로운 진단 분석의 평가를 통한 지속적인 품질 개선(QI)은 임상 검사 의학의 매우 중요한 구성 요소입니다. 이에 따라 조사관은 진단 서비스를 강화하고 감염 진단 테스트의 민감도를 높이며 mNGS에 대한 기존 표준 진단 절차를 비교하기 위한 QI 이니셔티브로서 실험실에서 mNGS 사용을 평가하는 데 관심이 있습니다. 조사관은 외부 평가의 형태로 이를 수행할 계획이며, 이에 따라 Wellington Southern Community Laboratories(WSCL)의 샘플은 mNGS 테스트를 위해 환경 과학 및 연구 연구소(ESR)로 전달됩니다. ESR은 시퀀싱 및 생물 정보학에 대한 기존 전문 지식을 보유하고 있으며 이미 mNGS 기능을 개발했지만 실제 환자 샘플에서 포괄적으로 평가하지는 않았습니다. 초기 평가는 WSCL에서 사용할 수 있는 워크플로우 생성을 목표로 ESR에서 수행됩니다.

WSCL에서 ESR로 샘플 선택 및 추천

1. 일상적인 환자 관리의 일부로 수집되어 감염 진단 목적으로 WSCL 미생물학 실험실로 보내진 잔여 샘플이 사용됩니다. ESR과 같은 외부 실험실에 샘플을 의뢰하는 것을 포함하여 진단 프로세스를 최적화하기 위해 미생물학자가 특정 임상 샘플에 대한 추가(요청하지 않은) 테스트를 준비하는 것은 실험실에서 표준으로 허용되는 관행입니다. 이 평가는 유사한 절차를 따릅니다.
2. 샘플은 프로젝트에 관련된 임상 미생물학자가 WSCL에서 식별합니다. 다양한 샘플 유형이 평가됩니다. 평가에서 평가될 특정 샘플 유형은 mNGS 워크플로가 다양한 샘플 유형에서 얼마나 잘 작동하는지에 따라 평가 과정에서 달라집니다. 처음에는 일반적으로 무균 부위의 검체와 잠재적으로 환자 치료에 가장 긍정적인 영향을 미치는 검체를 선택합니다(예: 뇌척수액, 관절액, 흉막액, 혈액), 비멸균 부위(예: 가래, 소변, 상처액) 초기 결과가 고무적인 경우.
3. WSCL은 전체 Capital & Coast 및 Hutt Valley DHB 지역에 대한 미생물 샘플을 처리하므로 샘플은 이 지역의 환자로부터 공급됩니다. 대부분의 샘플은 지역사회 기반이 아닌 입원 환자로부터 수집됩니다. 다양한 임상 전문 분야의 샘플을 평가할 것입니다. 성인 및 신생아 집중 치료실 및 일반 병동 환자.

샘플 크기 1. 이 평가를 위해 특정 샘플 크기는 계산되지 않았습니다. 테스트된 샘플의 총 수는 mNGS 테스트 프로세스의 개선이 얼마나 필요한지에 따라 달라지며 평가는 지속적인 프로세스가 되어야 할 가능성이 높습니다. 조사관은 최대 샘플 크기를 400으로 설정했습니다.

mNGS 방법론

1. 임상 샘플은 폴리라이신으로 기능화된 고체상 가역 고정화(SPRI) 자기 비드를 사용하여 박테리아 세포를 풍부하게 하기 위해 처리될 것입니다. 숙주(인간) DNA는 차등 용해 및 뉴클레아제 처리를 사용하여 고갈됩니다.
2. 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트를 사용하여 처리된 샘플에서 전체 핵산을 추출합니다.
3. ONT 래피드 시퀀싱 키트는 생성된 DNA를 시퀀싱하는 데 사용됩니다.
4. 샘플에서 잠재적인 병원체 종을 식별하기 위해 생성된 모든 비인간 시퀀스는 맞춤형 병원체 데이터베이스에 대한 빠른 최소화 기반 근사 매핑 알고리즘을 사용하여 분류학적으로 종 수준으로 분류됩니다.

숙주(인간) 게놈 시퀀싱의 회피 의도하지 않은 인간 게놈 시퀀싱의 가능성을 피하기 위해 여러 가지 공개된 전략을 포함하는 견고한 프로세스가 시행될 것입니다.

1. 샘플에서 숙주 DNA 감소:

   ㅏ. 프로토콜의 초기 샘플 처리 단계에서 박테리아 세포 농축 및 호스트 DNA의 화학적 고갈은 샘플에서 호스트 DNA의 양을 줄임으로써 인간 DNA 시퀀싱을 피하는 첫 번째 라인이 될 것입니다.

2. 시퀀서에서 호스트 DNA 꺼내기:

   ㅏ. 호스트 시퀀싱을 줄이기 위한 두 번째 필터는 ONT '읽기 전까지' API를 사용합니다. 이 프로세스는 1초 이내에 검출기를 통해 분자의 이동 방향을 반전시켜 미리 지정된 DNA 시퀀스가 ​​검출기로 들어가는 것을 자동으로 방지하여 전체 길이의 호스트 분자가 시퀀스되는 것을 방지합니다. 시퀀스 데이터의 원시 오류율이 주어지면 이 필터를 통과하는 짧은 호스트 읽기는 분석할 정보가 충분하지 않습니다.

3. 호스트 시퀀스 삭제:

   ㅏ. 호스트 서열이 분석에 노출되는 것을 방지하기 위한 마지막 단계는 데이터 스트림이 분석 단계에 들어가기 전에 생산되는 잔류 인간 서열 데이터를 자동으로 영구적으로 삭제하는 것입니다.

4. 미생물 데이터베이스에 대해서만 시퀀스 매핑:

   1. 호스트 시퀀스가 ​​위의 단계를 통과하는 매우 드문 경우에 추가 안전 단계는 모든 시퀀스가 ​​미생물 데이터베이스에 대해서만 매핑된다는 것입니다. 즉, 인간 시퀀스는 일치 항목을 생성하지 않으므로 분석의 일부가 되지 않습니다.

결과 보고

1. 결과는 ESR이 WSCL에 대해 수행하는 다른 참조 테스트에 사용되는 것과 동일한 보안 경로를 통해 WSCL에 직접 보고됩니다.
2. 결과는 프로젝트에 참여하는 임상 미생물학자가 검토하여 임상 팀에 결과를 제공하기 전에 임상 관련성을 평가할 수 있습니다.
3. 결과는 WSCL 실험실 정보 시스템에 입력되어 임상 팀에 보고될 수 있습니다. 아직 평가 중인 mNGS를 사용하여 결과가 생성되었음을 설명하는 의견이 텍스트 보고서에 첨부되며, 미생물학자는 결과를 둘러싼 불확실성의 가능성이 있는 경우 결과에 대해 임상 팀과 직접 논의합니다.

결과 평가

1. 병렬 mNGS 테스트의 결과는 동일한 샘플에 대한 일상적인 실험실 테스트에서 생성된 결과와 시간이 지남에 따라 비교되어 민감도, 특이성 및 방법 간의 일치 수준을 평가합니다. mNGS가 일상적인 방법보다 잠재적으로 더 민감하다는 점을 감안할 때 mNGS 결과는 다른 실험실 테스트, 방사선학 및 전반적인 임상 환자의 평가.
2. mNGS 테스트의 임상적 영향도 평가되고 기록됩니다. 각 mNGS 결과에 대해 임상 미생물학자는 mNGS 결과가 환자의 전반적인 평가 및 관리에 미치는 임상적 영향에 대해 평가합니다.