Evaluatie van een mNGS-workflow voor infectiediagnose met behulp van Oxford Nanopore Sequencing.

Diagnostische microbiologie omvatte traditioneel het kweken van organismen om infectie te diagnosticeren, wat tijdrovend is, ongevoelig voor organismen die moeilijk te kweken zijn en aangetast door eerdere antimicrobiële therapie. Moleculaire diagnostiek, voornamelijk in de vorm van nucleïnezuuramplificatietesten (NAAT), b.v. PCR heeft een aantal van deze beperkingen overwonnen en wordt nu op grote schaal en in toenemende mate gebruikt. Op NAAT gebaseerde tests zijn echter beperkt doordat ze slechts een klein aantal vooraf gespecificeerde organismen kunnen detecteren en kunnen beperkte tot geen antimicrobiële gevoeligheidsinformatie bieden.

Metagenomic next generation sequencing (mNGS) werkt door direct al het nucleïnezuur in een microbiologisch monster te sequensen, waardoor identificatie van alle micro-organismen die in voldoende hoeveelheid aanwezig zijn mogelijk is, samen met het potentieel om antimicrobiële gevoeligheidspatronen af ​​te leiden op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van relevante genen. In tegenstelling tot NAAT is er geen voorspecificatie van doelpathogenen vereist, dus mNGS heeft het potentieel om belangrijke pathogenen te identificeren waarop anders misschien niet is getest. Gastheer (menselijke) sequenties zullen ook aanwezig zijn in het monster, dus worden verwijderd uit de analyse ofwel door te voorkomen dat ze gesequenced worden, ofwel door ze te verwijderen tijdens de initiële analysestappen.

mNGS heeft daarom het vermogen om de beperkingen van zowel op cultuur gebaseerde als op NAAT gebaseerde infectiediagnose te overwinnen, met het potentieel om snelle diagnostiek te bieden met grotere niveaus van antimicrobiële gevoeligheidsdetails, die minder wordt beïnvloed door het feit of het organisme levensvatbaar/kweekbaar is. Snelle infectiediagnostiek heeft het vermogen om de patiëntenzorg aanzienlijk te verbeteren, waarbij de juiste gerichte antimicrobiële therapie snel kan worden ingesteld (of kan worden stopgezet als bijvoorbeeld een viraal pathogeen wordt geïdentificeerd). Dit is van bijzonder belang gezien de voortdurende wereldwijde toename van antimicrobiële resistentie. Snelle diagnostiek met mNGS kan ook de behoefte aan meerdere andere onderzoekslijnen verminderen. Er zijn waarschijnlijk bepaalde patiëntengroepen waarop deze technologie bijzonder gericht kan zijn voor maximaal voordeel, hetzij vanwege de snelheid van de resultaten of het vermogen om infecties te diagnosticeren die mogelijk niet klinisch worden vermoed of gedetecteerd met standaardprocessen. Op de onderzoeksafdeling zijn onlangs verschillende gevallen gezien waarbij patiënten zeer slechte resultaten hadden als gevolg van vertragingen in de diagnose, waarbij mNGS het potentieel had gehad om hun resultaten aanzienlijk te verbeteren. Er zijn ook potentiële voordelen op bevolkingsniveau, zoals het verminderen van de blootstelling van de bevolking aan al te breedspectrumantibiotica, snelle identificatie en bewaking van overdraagbare ziekten die mogelijk een reactie van de volksgezondheid vereisen, en het bespoedigen van passend beheer en de doorstroom van patiënten door middel van een reeds overbelast ziekenhuissysteem. mNGS heeft ook de mogelijkheid om nieuwe ziekteverwekkers te detecteren. De snelle identificatie en verspreiding van informatie met betrekking tot SARS-CoV-2 was bijvoorbeeld te danken aan de beschikbaarheid van snelle 'agnostische' sequentietechnologieën.

Sequencing van de volgende generatie is doorgaans te duur geweest om te worden gebruikt als eerstelijns diagnostische test, en het gebruik ervan is beperkt tot grotere aan onderzoek gelieerde instellingen. Nanopore-sequencing (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) biedt nu echter een relatief goedkope optie, met een kleine fysieke voetafdruk en de mogelijkheid om snel een grote hoeveelheid sequentiegegevens te genereren, waardoor het een potentieel levensvatbare optie is voor eerstelijns diagnostische microbiologie laboratoria. Als zodanig is er veel belangstelling voor het gebruik van nanopore-sequencing voor mNGS. In een aantal publicaties is melding gemaakt van het gebruik ervan in de klinische diagnostiek en het wordt al gebruikt in een aantal zorginstellingen in het buitenland

. Continue kwaliteitsverbetering (QI) via de evaluatie van nieuwe diagnostische assays is een cruciaal onderdeel van de klinische laboratoriumgeneeskunde. In overeenstemming hiermee zijn de onderzoekers geïnteresseerd in het evalueren van het gebruik van mNGS in hun laboratorium als een QI-initiatief om de diagnostische service te verbeteren, de gevoeligheid van diagnostische tests voor infecties te vergroten en bestaande standaard diagnostische procedures te vergelijken met mNGS. De onderzoekers zijn van plan dit uit te voeren in de vorm van een externe evaluatie, waarbij monsters van Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) worden doorgestuurd naar het Institute of Environmental Sciences and Research (ESR) voor mNGS-testen. ESR heeft bestaande expertise op het gebied van sequencing en bio-informatica en heeft al mNGS-mogelijkheden ontwikkeld, maar heeft deze nog niet volledig geëvalueerd op monsters van echte patiënten. De eerste evaluatie zou plaatsvinden bij ESR, met als doel een workflow te produceren die bruikbaar zou kunnen zijn bij WSCL.

Steekproefselectie en doorverwijzing van WSCL naar ESR

1. Restmonsters die zijn verzameld als onderdeel van routinematige patiëntenzorg en die naar het WSCL-microbiologisch laboratorium zijn gestuurd voor het diagnosticeren van een infectie, zullen worden gebruikt. Het is standaard geaccepteerde praktijk in het laboratorium dat de microbioloog aanvullende (ongevraagde) testen op bepaalde klinische monsters regelt om het diagnostisch proces te optimaliseren, inclusief verwijzing van monsters naar een extern laboratorium zoals ESR. Deze evaluatie zou een soortgelijke procedure volgen.
2. Monsters zullen op WSCL worden geïdentificeerd door de klinische microbioloog(en) die bij het project betrokken zijn. Er zullen verschillende soorten monsters worden beoordeeld. De specifieke monstertypen die in de evaluatie worden beoordeeld, variëren in de loop van de evaluatie, op basis van hoe goed de mNGS-workflow functioneert op verschillende monstertypen. In eerste instantie zullen monsters worden gekozen van normaal gesproken steriele locaties en locaties met mogelijk de grootste positieve impact op de patiëntenzorg (bijv. cerebrospinale vloeistof, gewrichtsvloeistof, pleuravocht, bloed) gevolgd door monsters van niet-steriele plaatsen (bijv. sputum, urine, wondvocht) als de eerste resultaten bemoedigend zijn.
3. WSCL verwerkt microbiologische monsters voor de gehele DHB-regio's Capital & Coast en Hutt Valley, zodat monsters afkomstig zijn van patiënten in deze regio's. De meerderheid van de monsters zal afkomstig zijn van gehospitaliseerde patiënten, in plaats van gemeenschapsgebaseerd. Er zullen monsters van verschillende klinische specialismen worden geëvalueerd, waaronder augmented care units, b.v. zowel volwassen als neonatale intensive care-afdelingen en patiënten op de algemene afdeling.

Steekproefgrootte 1. Er is geen specifieke steekproefomvang berekend voor deze evaluatie, aangezien het totale aantal geteste monsters afhankelijk is van hoeveel verfijning van het mNGS-testproces vereist is, en de evaluatie zal waarschijnlijk een doorlopend proces moeten zijn. De onderzoekers hebben een maximale steekproefomvang vastgesteld op 400.

mNGS-methodiek

1. Klinische monsters zullen worden verwerkt om bacteriële cellen te verrijken met behulp van vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) magnetische bolletjes gefunctionaliseerd met poly-lysine. Gastheer (menselijk) DNA zal worden uitgeput met behulp van differentiële lysis en nucleasebehandeling.
2. Totaal nucleïnezuur zal worden geëxtraheerd uit de verwerkte monsters met behulp van in de handel verkrijgbare DNA-extractiekits.
3. ONT rapid sequencing kit zal worden gebruikt om het resulterende DNA te sequensen.
4. Om potentiële ziekteverwekkers in het monster te identificeren, zullen alle gegenereerde niet-menselijke sequenties taxonomisch worden geclassificeerd tot op soortniveau met behulp van een snel op minimisers gebaseerd algoritme voor het in kaart brengen van op maat gemaakte ziekteverwekkers.

Vermijden van sequentiebepaling van het gastheergenoom (van de mens) Er zullen robuuste processen worden ingevoerd waarbij verschillende gepubliceerde strategieën betrokken zijn om de mogelijkheid van onbedoelde sequentiebepaling van het menselijk genoom te voorkomen.

1. Gastheer-DNA in het monster reduceren:

   A. Bacteriële celverrijking en chemische uitputting van gastheer-DNA tijdens de initiële monsterverwerkingsfase van het protocol zullen de eerste lijn zijn om de sequentiebepaling van menselijk DNA te vermijden door de hoeveelheid gastheer-DNA in het monster te verminderen.

2. Host-DNA uit de sequencer uitwerpen:

   A. Het tweede filter om host-sequencing te verminderen, is het gebruik van de ONT 'Read Until' API. Dit proces voorkomt automatisch dat vooraf gespecificeerde DNA-sequenties de detector binnendringen door de bewegingsrichting van het molecuul door de detector binnen minder dan een seconde om te keren, waardoor wordt voorkomen dat de sequentie van gastheermoleculen van volledige lengte wordt bepaald. Gezien het ruwe foutpercentage van de sequentiegegevens, bevat elke korte host-lezing die dit filter passeert onvoldoende informatie om te worden geanalyseerd.

3. Hostsequenties verwijderen:

   A. De laatste stap om te voorkomen dat de hostsequentie aan analyse wordt blootgesteld, is het automatisch en permanent verwijderen van resterende menselijke sequentiegegevens wanneer deze worden geproduceerd, voordat de gegevensstroom de analysestap binnengaat.

4. Sequenties alleen in kaart brengen tegen microbiële databases:

   1. In het zeer onwaarschijnlijke geval dat de hostsequentie de bovenstaande stappen doorstaat, is een verdere veiligheidsstap dat eventuele sequenties alleen worden toegewezen aan microbiële databases. Dit betekent dat menselijke sequenties geen match zouden creëren en dus geen deel zouden uitmaken van de analyse.

Rapportage van resultaten

1. De resultaten worden door ESR rechtstreeks aan WSCL gerapporteerd via dezelfde beveiligde paden die worden gebruikt voor andere referentietests die ESR voor WSCL uitvoert.
2. De resultaten zullen worden beoordeeld door de klinische microbioloog(en) die bij het project betrokken zijn, zodat een beoordeling van hun klinische relevantie kan worden gemaakt voordat de resultaten beschikbaar worden gesteld aan de klinische teams.
3. Resultaten worden ingevoerd in het WSCL-laboratoriuminformatiesysteem, zodat ze kunnen worden gerapporteerd aan het klinische team. Er zal een opmerking bij het tekstrapport worden gevoegd waarin wordt uitgelegd dat de resultaten zijn gegenereerd met behulp van mNGS, dat nog steeds wordt geëvalueerd, en de microbioloog zal de resultaten rechtstreeks met het klinische team bespreken als er mogelijk onzekerheid bestaat over het resultaat.

Evaluatie van resultaten

1. De resultaten van de parallelle mNGS-testen zullen in de loop van de tijd worden vergeleken met de resultaten van routinematige laboratoriumtesten op hetzelfde monster, om de gevoeligheid, specificiteit en mate van overeenstemming tussen methoden te beoordelen. Aangezien mNGS potentieel gevoeliger is dan routinemethoden, zullen mNGS-resultaten ook worden beoordeeld door de klinische microbioloog(en) die bij het project betrokken zijn aan de hand van ander routinematig diagnostisch (orthogonaal) testen, waaronder andere laboratoriumtesten, radiologie en de algehele klinische beoordeling van de patiënt.
2. De klinische impact van de mNGS-testen zal ook worden beoordeeld en vastgelegd: voor elk mNGS-resultaat zal de klinisch microbioloog(en) een inschatting maken van de klinische impact die het mNGS-resultaat had op de algehele beoordeling en behandeling van de patiënt.