Vyhodnocení pracovního postupu mNGS pro diagnostiku infekce pomocí Oxford Nanopore Sequencing.

Diagnostická mikrobiologie tradičně zahrnuje kultivaci organismů k diagnostice infekce, což je časově náročné, necitlivé pro organismy, které se obtížně pěstují, a kompromitované předchozí antimikrobiální terapií. Molekulární diagnostika, převážně ve formě testů amplifikace nukleových kyselin (NAAT), např. PCR, překonávají některá z těchto omezení a jsou nyní široce a stále častěji používány. Testy založené na NAAT jsou však omezené tím, že jsou schopny detekovat pouze malý počet předem specifikovaných organismů a mohou poskytnout omezené nebo žádné informace o antimikrobiální citlivosti.

Metagenomické sekvenování nové generace (mNGS) funguje tak, že přímo sekvenuje veškerou nukleovou kyselinu v mikrobiologickém vzorku, což umožňuje identifikaci všech mikroorganismů, které jsou přítomny v dostatečném množství, spolu s potenciálem odvodit vzorce antimikrobiální citlivosti na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti relevantní geny. Na rozdíl od NAAT není vyžadována žádná předběžná specifikace cílového patogenu (patogenů), takže mNGS má potenciál identifikovat důležité patogeny, na které možná nebyly jinak testovány. Hostitelské (lidské) sekvence budou také přítomny ve vzorku, takže jsou odstraněny z analýzy buď tím, že se jim zabrání v sekvenování, nebo se odstraní během počátečních kroků analýzy.

mNGS má proto schopnost překonat omezení diagnostiky infekcí jak na kultivaci, tak na NAAT, s potenciálem nabídnout rychlou diagnostiku s větší úrovní detailů antimikrobiální citlivosti, která je méně ovlivněna tím, zda je organismus životaschopný/kultivovatelný. Rychlá diagnostika infekcí má schopnost významně zlepšit péči o pacienty, přičemž vhodně cílená antimikrobiální terapie může být okamžitě zahájena (nebo ukončena, pokud je identifikován např. virový patogen). To je zvláště důležité vzhledem k pokračujícímu celosvětovému nárůstu antimikrobiální rezistence. Rychlá diagnostika pomocí mNGS může také snížit potřebu mnoha dalších linií vyšetřování. Pravděpodobně existují určité skupiny pacientů, na které může být tato technologie zvláště zaměřena pro maximální užitek, ať už kvůli rychlosti výsledků nebo schopnosti diagnostikovat infekce, které nemusely být klinicky podezřelé nebo detekovány standardními procesy. Na oddělení vyšetřovatelů bylo v poslední době pozorováno několik případů, kdy pacienti měli velmi špatné výsledky v důsledku zpoždění v diagnóze, kde by mNGS měla potenciál výrazně zlepšit jejich výsledky. Existují také potenciální výhody na úrovni populace, jako je snížení expozice populace příliš širokospektrým antibiotikům, rychlá identifikace a dohled nad přenosnými nemocemi, které mohou vyžadovat reakci veřejného zdraví, a urychlení vhodného řízení a toku pacientů již dříve přetížený nemocniční systém. mNGS má také schopnost detekovat nové patogeny. Například rychlá identifikace a šíření informací týkajících se SARS-CoV-2 bylo způsobeno dostupností rychlých „agnostických“ sekvenačních technologií.

Sekvenování nové generace bylo obvykle příliš drahé na to, aby se dalo použít jako diagnostický test v první linii, přičemž jeho použití je omezeno na větší instituce přidružené k výzkumu. Sekvenování nanoporů (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) však nyní nabízí relativně levnou možnost s malou fyzickou stopou a schopností rychle generovat velké množství sekvenčních dat, což z něj činí potenciálně životaschopnou možnost pro diagnostickou mikrobiologii v první linii. laboratoří. Jako takový existuje značný zájem o použití sekvenování nanopórů pro mNGS. Řada publikací informovala o jeho použití v klinické diagnostice a již se používá v řadě zdravotnických zařízení v zámoří

. Neustálé zlepšování kvality (QI) prostřednictvím hodnocení nových diagnostických testů je kriticky důležitou součástí klinické laboratorní medicíny. V souladu s tím mají vyšetřovatelé zájem vyhodnotit používání mNGS ve své laboratoři jako iniciativu QI s cílem zlepšit diagnostickou službu, zvýšit citlivost diagnostického testování infekcí a porovnat stávající standardní diagnostické postupy s mNGS. Vyšetřovatelé to plánují provést formou externího hodnocení, přičemž vzorky z Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) budou předány Institutu environmentálních věd a výzkumu (ESR) k testování mNGS. ESR má existující odborné znalosti v oblasti sekvenování a bioinformatiky a již vyvinula schopnost mNGS, ale komplexně ji nevyhodnotila na skutečných vzorcích pacientů. Počáteční hodnocení by proběhlo v ESR s cílem vytvořit pracovní postup, který by mohl být použitelný ve WSCL.

Výběr vzorku a doporučení z WSCL do ESR

1. Budou použity zbytkové vzorky, které byly odebrány v rámci běžné péče o pacienta a odeslány do mikrobiologické laboratoře WSCL pro účely diagnostiky infekce. Je standardní uznávanou praxí v laboratoři, že mikrobiolog zařídí dodatečné (nevyžádané) testování určitých klinických vzorků za účelem optimalizace diagnostického procesu, včetně odeslání vzorků do externí laboratoře, jako je ESR. Toto hodnocení by mělo podobný postup.
2. Vzorky budou identifikovány na WSCL klinickým mikrobiologem (mi) zapojeným do projektu. Bude hodnocena řada typů vzorků. Konkrétní typy vzorků, které budou při hodnocení hodnoceny, se budou v průběhu hodnocení lišit v závislosti na tom, jak dobře funguje pracovní postup mNGS na různých typech vzorků. Nejprve budou vybrány vzorky z normálně sterilních míst a míst s potenciálně největším pozitivním dopadem na péči o pacienta (např. cerebrospinální mok, kloubní mok, pleurální mok, krev) následované vzorky z nesterilních míst (např. sputum, moč, tekutiny z rány), pokud jsou počáteční výsledky povzbudivé.
3. WSCL zpracovává mikrobiologické vzorky pro celé regiony Capital & Coast a Hutt Valley DHB, takže vzorky by pocházely od pacientů v těchto regionech. Většina vzorků bude pocházet spíše od hospitalizovaných pacientů než od komunitních. Budou hodnoceny vzorky z řady různých klinických specializací, včetně jednotek rozšířené péče, např. na jednotkách intenzivní péče pro dospělé i novorozence a pacientů na obecném oddělení.

Velikost vzorku 1. Pro toto hodnocení nebyla vypočítána konkrétní velikost vzorku, protože celkový počet testovaných vzorků bude záviset na tom, do jaké míry je vyžadováno upřesnění procesu testování mNGS, a hodnocení bude pravděpodobně muset být průběžný proces. Vyšetřovatelé stanovili maximální velikost vzorku na 400.

metodika mNGS

1. Klinické vzorky budou zpracovány pro obohacení o bakteriální buňky pomocí magnetických kuliček s reverzibilní imobilizací na pevné fázi (SPRI) funkcionalizovaných polylysinem. Hostitelská (lidská) DNA bude depletována pomocí diferenciální lýzy a ošetření nukleázou.
2. Celková nukleová kyselina bude extrahována ze zpracovaných vzorků pomocí komerčně dostupných souprav pro extrakci DNA.
3. K sekvenování výsledné DNA bude použita rychlá sekvenační souprava ONT.
4. K identifikaci potenciálních druhů patogenů ve vzorku budou všechny generované nehumánní sekvence taxonomicky klasifikovány na úroveň druhu pomocí rychlého přibližného mapovacího algoritmu založeného na minimalizaci proti přizpůsobeným databázím patogenů.

Zamezení sekvenování hostitelského (lidského) genomu Budou zavedeny robustní procesy zahrnující několik různých publikovaných strategií, aby se zabránilo možnosti neúmyslného sekvenování lidského genomu.

1. Redukce hostitelské DNA ve vzorku:

   A. Obohacení bakteriálních buněk a chemická deplece hostitelské DNA během počáteční fáze zpracování vzorku protokolu bude první linií, jak se vyhnout sekvenování lidské DNA snížením množství hostitelské DNA ve vzorku.

2. Vysunutí hostitelské DNA ze sekvenátoru:

   A. Druhým filtrem pro snížení sekvenování hostitele bude použití API ONT 'Read Until'. Tento proces automaticky zabraňuje vstupu předem specifikovaných sekvencí DNA do detektoru tím, že obrátí směr pohybu molekuly detektorem za méně než jednu sekundu, čímž se zabrání sekvenování jakýchkoli hostitelských molekul v plné délce. Vzhledem k hrubé chybovosti sekvenčních dat nesou jakákoli krátká čtení hostitele, která projdou tímto filtrem, nedostatečné informace k analýze.

3. Mazání hostitelských sekvencí:

   A. Posledním krokem, jak se vyhnout vystavení hostitelské sekvence analýze, je automatické a trvalé vymazání veškerých zbytkových dat lidské sekvence tak, jak jsou vytvářena, před tím, než datový tok vstupuje do kroku analýzy.

4. Mapování sekvencí pouze proti mikrobiálním databázím:

   1. Ve velmi nepravděpodobném případě, že hostitelská sekvence projde výše uvedenými kroky, dalším bezpečnostním krokem je, že jakékoli sekvence budou mapovány pouze proti mikrobiálním databázím. To znamená, že žádné lidské sekvence by nevytvořily shodu, takže by nebyly součástí analýzy.

Hlášení výsledků

1. Výsledky budou reportovány ESR přímo do WSCL prostřednictvím stejných bezpečných cest používaných pro jiné referenční testování, které ESR provádí pro WSCL.
2. Výsledky budou přezkoumány klinickým mikrobiologem (mi) zapojeným do projektu, aby bylo možné posoudit jejich klinickou relevanci před tím, než budou výsledky zpřístupněny klinickým týmům.
3. Výsledky budou vloženy do laboratorního informačního systému WSCL, aby mohly být hlášeny klinickému týmu. K textové zprávě bude připojen komentář vysvětlující, že výsledky byly generovány pomocí mNGS, která se stále vyhodnocuje, a mikrobiolog bude o výsledcích diskutovat přímo s klinickým týmem, pokud existuje potenciál pro nejistotu ohledně výsledku.

Vyhodnocení výsledků

1. Výsledky paralelního testování mNGS budou porovnávány v průběhu času s výsledky získanými rutinním laboratorním testováním na stejném vzorku, aby se vyhodnotila citlivost, specificita a úroveň shody mezi metodami. Vzhledem k tomu, že mNGS je potenciálně citlivější než rutinní metody, výsledky mNGS budou také posuzovány klinickým mikrobiologem zapojeným do projektu oproti jiným rutinním diagnostickým (ortogonálním) testům, které by mohly zahrnovat další laboratorní testy, radiologii a celkové klinické vyšetření. posouzení pacienta.
2. Klinický dopad testování mNGS bude také posouzen a zaznamenán: pro každý výsledek mNGS klinický mikrobiolog(i) vyhodnotí klinický dopad, který měl výsledek mNGS na celkové hodnocení a léčbu pacienta.