Evaluación de un flujo de trabajo de mNGS para el diagnóstico de infecciones utilizando la secuenciación Oxford Nanopore.

La microbiología diagnóstica ha implicado tradicionalmente el cultivo de organismos para diagnosticar infecciones, lo que requiere mucho tiempo, es insensible a los organismos que son difíciles de cultivar y se ve comprometido por la terapia antimicrobiana previa. Diagnóstico molecular, predominantemente en forma de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), p. PCR, superaron algunas de estas limitaciones y ahora son de uso generalizado y creciente. Sin embargo, las pruebas basadas en NAAT están limitadas porque solo pueden detectar una pequeña cantidad de organismos preespecificados y pueden ofrecer información limitada o nula sobre la susceptibilidad a los antimicrobianos.

La secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) funciona mediante la secuenciación directa de todo el ácido nucleico en una muestra microbiológica, lo que permite la identificación de todos los microorganismos que están presentes en cantidad suficiente, junto con la posibilidad de inferir patrones de susceptibilidad antimicrobiana basados ​​en la presencia o ausencia de genes relevantes. A diferencia de NAAT, no se requiere una especificación previa de los patógenos objetivo, por lo que mNGS tiene el potencial de identificar patógenos importantes que de otro modo no se habrían analizado. Las secuencias del huésped (humano) también estarán presentes en la muestra, por lo que se eliminan del análisis evitando que se secuencien o eliminándolas durante los pasos iniciales del análisis.

Por lo tanto, mNGS tiene la capacidad de superar las limitaciones del diagnóstico de infecciones basado en cultivos y NAAT, con el potencial de ofrecer diagnósticos rápidos con mayores niveles de detalle de susceptibilidad a los antimicrobianos, que se ve menos afectado por si el organismo es viable/cultivable. El diagnóstico rápido de infecciones tiene la capacidad de mejorar significativamente la atención al paciente, por lo que la terapia antimicrobiana dirigida apropiadamente puede instituirse rápidamente (o suspenderse si, por ejemplo, se identifica un patógeno viral). Esto es de particular importancia dado el continuo aumento global de la resistencia a los antimicrobianos. Los diagnósticos rápidos con mNGS también pueden reducir la necesidad de muchas otras líneas de investigación. Es probable que haya ciertos grupos de pacientes en los que esta tecnología pueda ser un objetivo particular para obtener el máximo beneficio, ya sea debido a la rapidez de los resultados o la capacidad de diagnosticar infecciones que pueden no haberse sospechado clínicamente o detectado con procesos estándar. En el departamento de investigadores, recientemente se han visto varios casos en los que los pacientes han tenido resultados muy deficientes debido a retrasos en el diagnóstico, donde la mNGS habría tenido el potencial de mejorar notablemente sus resultados. También existen beneficios potenciales a nivel de la población, como la reducción de la exposición de la población a antibióticos de espectro demasiado amplio, la identificación y vigilancia rápidas de enfermedades transmisibles que pueden requerir una respuesta de salud pública, y la aceleración del manejo y flujo de pacientes adecuados a través de un sistema ya existente. Sistema hospitalario congestionado. mNGS también tiene la capacidad de detectar nuevos patógenos. A modo de ejemplo, la rápida identificación y difusión de información relacionada con el SARS-CoV-2 se debió a la disponibilidad de tecnologías de secuenciación "agnósticas" rápidas.

Por lo general, la secuenciación de próxima generación ha sido demasiado costosa para ser utilizada como una prueba de diagnóstico de primera línea, y su uso se limita a instituciones afiliadas a la investigación más grandes. Sin embargo, la secuenciación de nanoporos (Oxford Nanopore Technologies [ONT]), ahora ofrece una opción relativamente económica, con un tamaño físico pequeño y la capacidad de generar una gran cantidad de datos de secuencia rápidamente, lo que la convierte en una opción potencialmente viable para la microbiología de diagnóstico de primera línea. laboratorios. Como tal, existe un interés considerable en el uso de la secuenciación de nanoporos para mNGS. Varias publicaciones han informado sobre su uso en diagnósticos clínicos y ya está en uso en varios entornos de atención médica en el extranjero.

. La mejora continua de la calidad (QI) a través de la evaluación de nuevos ensayos de diagnóstico es un componente de importancia crítica de la medicina de laboratorio clínico. De acuerdo con esto, los investigadores están interesados ​​en evaluar el uso de mNGS en su laboratorio como una iniciativa de QI para mejorar el servicio de diagnóstico, aumentar la sensibilidad de las pruebas de diagnóstico de infecciones y comparar los procedimientos de diagnóstico estándar existentes con mNGS. Los investigadores planean realizar esto en forma de una evaluación externa, mediante la cual las muestras de Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) se enviarían al Instituto de Ciencias e Investigación Ambientales (ESR) para la prueba de mNGS. ESR tiene experiencia existente en secuenciación y bioinformática y ya ha desarrollado la capacidad mNGS, sin embargo, no la ha evaluado exhaustivamente en muestras de pacientes reales. La evaluación inicial ocurriría en ESR, con el objetivo de producir un flujo de trabajo que pudiera usarse en WSCL.

Selección de muestras y derivación de WSCL a ESR

1. Se utilizarán las muestras residuales que se hayan recolectado como parte de la atención rutinaria del paciente y se hayan enviado al laboratorio de microbiología de WSCL con el fin de diagnosticar infecciones. Es una práctica estándar aceptada en el laboratorio que el microbiólogo organice pruebas adicionales (no solicitadas) en ciertas muestras clínicas para optimizar el proceso de diagnóstico, incluida la derivación de muestras a un laboratorio externo como ESR. Esta evaluación seguiría un procedimiento similar.
2. Las muestras serán identificadas en WSCL por los microbiólogos clínicos involucrados en el proyecto. Se evaluará una variedad de tipos de muestras. Los tipos de muestra específicos que se evaluarán en la evaluación variarán durante el curso de la evaluación, según qué tan bien funcione el flujo de trabajo de mNGS en diferentes tipos de muestra. Inicialmente, se elegirán muestras de sitios normalmente estériles y aquellas que tengan potencialmente el mayor impacto positivo en la atención del paciente (p. líquido cefalorraquídeo, líquido articular, líquido pleural, sangre) seguido de muestras de sitios no estériles (p. esputo, orina, fluidos de heridas) si los resultados iniciales son alentadores.
3. WSCL procesa muestras de microbiología para todas las regiones de Capital & Coast y Hutt Valley DHB, por lo que las muestras se obtendrán de pacientes en estas regiones. La mayoría de las muestras serán de pacientes hospitalizados y no de la comunidad. Se evaluarán muestras de una variedad de diferentes especialidades clínicas, incluidas las unidades de atención aumentada, p. unidades de cuidados intensivos para adultos y neonatales, y pacientes de sala general.

Tamaño de la muestra 1. No se calculó un tamaño de muestra específico para esta evaluación, ya que la cantidad total de muestras analizadas dependerá de cuánto refinamiento se requiera del proceso de prueba de mNGS, y es probable que la evaluación deba ser un proceso continuo. Los investigadores han fijado un tamaño de muestra máximo de 400.

metodología mNGS

1. Las muestras clínicas se procesarán para enriquecerlas con células bacterianas utilizando perlas magnéticas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) funcionalizadas con polilisina. El ADN del huésped (humano) se reducirá mediante lisis diferencial y tratamiento con nucleasas.
2. El ácido nucleico total se extraerá de las muestras procesadas utilizando kits de extracción de ADN disponibles comercialmente.
3. Se utilizará el kit de secuenciación rápida ONT para secuenciar el ADN resultante.
4. Para identificar posibles especies de patógenos en la muestra, todas las secuencias no humanas generadas se clasificarán taxonómicamente a nivel de especie utilizando un algoritmo de mapeo aproximado basado en un minimizador rápido contra bases de datos de patógenos personalizadas.

Evitar la secuenciación del genoma del huésped (humano) Se implementarán procesos robustos que involucran varias estrategias publicadas diferentes para evitar la posibilidad de una secuenciación inadvertida del genoma humano.

1. Reducción del ADN del huésped en la muestra:

   a. El enriquecimiento de células bacterianas y el agotamiento químico del ADN del huésped durante la etapa inicial de procesamiento de la muestra del protocolo serán la primera línea para evitar la secuenciación del ADN humano al reducir la cantidad de ADN del huésped en la muestra.

2. Expulsar el ADN del huésped del secuenciador:

   a. El segundo filtro para reducir la secuenciación del host será el uso de la API ONT 'Leer hasta'. Este proceso evita automáticamente que las secuencias de ADN preespecificadas entren en el detector al invertir la dirección de viaje de la molécula a través del detector en menos de un segundo, lo que evita que se secuencien las moléculas anfitrionas de longitud completa. Dada la tasa de error sin procesar de los datos de la secuencia, cualquier lectura corta del host que pase este filtro contiene información insuficiente para ser analizada.

3. Eliminación de secuencias anfitrionas:

   a. El paso final para evitar exponer la secuencia del huésped al análisis es eliminar de forma automática y permanente cualquier dato de secuencia humana residual a medida que se produce, antes de que el flujo de datos ingrese al paso de análisis.

4. Mapeo de secuencias solo contra bases de datos microbianas:

   1. En el caso muy improbable de que la secuencia del huésped supere los pasos anteriores, un paso de seguridad adicional es que las secuencias solo se mapearán en las bases de datos microbianas. Esto significa que cualquier secuencia humana no crearía una coincidencia, por lo que no formaría parte del análisis.

Reporte de resultados

1. ESR informará los resultados directamente a WSCL a través de las mismas vías seguras utilizadas para otras pruebas de referencia que ESR realiza para WSCL.
2. Los microbiólogos clínicos involucrados en el proyecto revisarán los resultados para que se pueda realizar una evaluación de su relevancia clínica antes de que los resultados estén disponibles para los equipos clínicos.
3. Los resultados se ingresarán en el sistema de información de laboratorio WSCL para que puedan ser informados al equipo clínico. Se adjuntará un comentario al informe de texto que explica que los resultados se generaron utilizando mNGS, que aún se está evaluando, y el microbiólogo hablará directamente con el equipo clínico sobre los resultados si existe alguna posibilidad de incertidumbre en torno al resultado.

Evaluación de resultados

1. Los resultados de las pruebas paralelas de mNGS se compararán a lo largo del tiempo con los resultados producidos por las pruebas de laboratorio de rutina en la misma muestra, para evaluar la sensibilidad, la especificidad y el nivel de concordancia entre los métodos. Dado que mNGS es potencialmente más sensible que los métodos de rutina, los microbiólogos clínicos involucrados en el proyecto también evaluarán los resultados de mNGS en comparación con otras pruebas de diagnóstico de rutina (ortogonales), que podrían incluir otras pruebas de laboratorio, radiología y la evaluación clínica general. valoración del paciente.
2. El impacto clínico de las pruebas de mNGS también se evaluará y registrará: para cada resultado de mNGS, los microbiólogos clínicos evaluarán el impacto clínico que tuvo el resultado de mNGS en la evaluación y el manejo generales del paciente.