评估使用牛津纳米孔测序进行感染诊断的 mNGS 工作流程。

诊断微生物学传统上涉及生物体培养以诊断感染，这非常耗时，对难以生长的生物体不敏感，并且受到先前的抗菌治疗的影响。 分子诊断，主要以核酸扩增试验 (NAAT) 的形式出现，例如 PCR 克服了其中的一些限制，现在得到广泛和越来越多的使用。 然而，基于 NAAT 的测试的局限性在于只能检测少量预先指定的生物体，并且只能提供有限甚至没有抗菌药敏信息。

宏基因组下一代测序 (mNGS) 的工作原理是直接对微生物样本中的所有核酸进行测序，从而可以鉴定出足量存在的所有微生物，并有可能根据存在或不存在的微生物来推断抗菌药敏感性模式相关基因。 与 NAAT 不同，不需要预先指定目标病原体，因此 mNGS 有可能识别出可能尚未经过其他测试的重要病原体。 宿主（人类）序列也将存在于样本中，因此可以通过阻止它们被测序或在初始分析步骤中删除它们来将其从分析中移除。

因此，mNGS 有能力克服基于培养和基于 NAAT 的感染诊断的局限性，并有可能提供具有更高水平的抗菌药敏感性细节的快速诊断，这受生物体是否可行/可培养的影响较小。 快速感染诊断能够显着改善患者护理，从而可以迅速开始适当靶向的抗微生物治疗（或在发现病毒病原体时停止）。 鉴于全球抗菌素耐药性持续增加，这一点尤为重要。 使用 mNGS 进行快速诊断还可以减少对其他多项研究的需求。 由于结果的快速性或诊断可能未被临床怀疑或用标准过程检测到的感染的能力，可能有某些患者群体可以特别针对该技术以获得最大利益。 在研究部门，最近发现了几例患者由于诊断延误而导致结果非常差的病例，而 mNGS 有可能显着改善他们的结果。 在人群层面也有潜在的好处，例如减少人群接触过于广谱的抗生素、快速识别和监测可能需要公共卫生应对的传染病，以及通过已经建立的系统加快适当的管理和患者流动。拥挤的医院系统。 mNGS 还具有检测新型病原体的能力。 例如，与 SARS-CoV-2 相关的信息的快速识别和传播是由于快速“不可知论”测序技术的可用性。

下一代测序通常过于昂贵，无法用作一线诊断测试，其使用仅限于较大的研究附属机构。 然而，纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies [ONT]）现在提供了一种相对便宜的选择，具有较小的物理足迹和快速生成大量序列数据的能力，使其成为一线诊断微生物学的潜在可行选择实验室。 因此，人们对将纳米孔测序用于 mNGS 非常感兴趣。 许多出版物报道了它在临床诊断中的应用，并且已经在海外的许多医疗机构中使用

.通过评估新的诊断分析持续改进质量 (QI) 是临床检验医学的一个极其重要的组成部分。 与此相一致，研究人员有兴趣评估 mNGS 在其实验室中的使用，作为 QI 计划，以加强诊断服务，提高感染诊断测试的灵敏度，并将现有标准诊断程序与 mNGS 进行比较。 研究人员计划以外部评估的形式进行这项工作，惠灵顿南部社区实验室 (WSCL) 的样本将被转发到环境科学研究所 (ESR) 进行 mNGS 测试。 ESR 在测序和生物信息学方面拥有现有的专业知识，并且已经开发了 mNGS 能力，但尚未对真实患者样本进行全面评估。 初步评估将在 ESR 进行，目的是生成可在 WSCL 上使用的工作流。

从 WSCL 到 ESR 的样本选择和推荐

1. 将使用作为常规患者护理的一部分收集并发送到 WSCL 微生物学实验室以诊断感染的残留样本。 微生物学家安排对某些临床样本进行额外的（未请求的）测试以优化诊断过程是实验室中公认的标准做法，包括将样本转介到外部实验室，例如 ESR。 该评估将遵循类似的程序。
2. 样本将由参与该项目的临床微生物学家在 WSCL 进行鉴定。 将评估各种样本类型。 将在评估中评估的特定样本类型在评估过程中会有所不同，具体取决于 mNGS 工作流程在不同样本类型上的运行情况。 最初将选择来自通常无菌场所和对患者护理可能具有最大积极影响的场所的样本（例如 脑脊液、关节液、胸膜液、血液），然后是非无菌部位的样本（例如 痰液、尿液、伤口液）如果初步结果令人鼓舞。
3. WSCL 处理整个首都与海岸和赫特河谷 DHB 地区的微生物学样本，因此样本将来自这些地区的患者。 大多数样本将来自住院患者，而不是来自社区。 来自各种不同临床专业的样本将被评估，包括增强护理单元，例如成人和新生儿重症监护病房，以及普通病房的患者。

样本量 1。 本次评估并未计算具体的样本量，因为测试的样本总数将取决于需要对 mNGS 测试过程进行多少改进，并且评估可能需要是一个持续的过程。 调查人员将最大样本量设置为 400。

mNGS 方法

1. 将使用聚赖氨酸功能化的固相可逆固定化 (SPRI) 磁珠对临床样本进行处理以富集细菌细胞。 宿主（人类）DNA 将使用差异裂解和核酸酶处理来耗尽。
2. 使用市售的 DNA 提取试剂盒从处理过的样品中提取总核酸。
3. ONT 快速测序试剂盒将用于对所得 DNA 进行测序。
4. 为了识别样本中潜在的病原体物种，所有生成的非人类序列将使用基于定制病原体数据库的快速最小化近似映射算法在分类学上分类到物种级别。

避免宿主（人类）基因组测序 将实施涉及几种不同已发表策略的稳健流程，以避免人类基因组测序无意中发生的可能性。

1. 减少样本中的宿主 DNA：

   A。在协议的初始样本处理阶段，宿主 DNA 的细菌细胞富集和化学消耗将是通过减少样本中宿主 DNA 的量来避免对人类 DNA 进行测序的第一道防线。

2. 从测序仪中弹出宿主 DNA：

   A。 减少主机排序的第二个过滤器将使用 ONT“Read Until”API。 该过程通过在不到一秒内反转分子通过检测器的行进方向，自动防止预先指定的 DNA 序列进入检测器，从而防止任何全长宿主分子被测序。 给定序列数据的原始错误率，任何通过此过滤器的短宿主读取携带的信息不足以进行分析。

3. 删除主机序列：

   A。 避免将宿主序列暴露给分析的最后一步是在数据流进入分析步骤之前自动永久删除任何残留的人类序列数据。

4. 仅针对微生物数据库映射序列：

   1. 在极不可能的情况下，宿主序列通过了上述步骤，进一步的安全步骤是任何序列将只映射到微生物数据库。 这意味着任何人类序列都不会创建匹配项，因此不会构成分析的一部分。

结果报告

1. 结果将由 ESR 通过与 ESR 为 WSCL 执行的其他参考测试相同的安全路径直接报告给 WSCL。
2. 结果将由参与该项目的临床微生物学家进行审查，以便在将结果提供给临床团队之前对其临床相关性进行评估。
3. 结果将输入 WSCL 实验室信息系统，以便将其报告给临床团队。 文本报告将附加一条评论，解释结果是使用 mNGS 生成的，该结果仍在评估中，如果结果存在任何不确定性，微生物学家将直接与临床团队讨论结果。

结果评价

1. 随着时间的推移，平行 mNGS 测试的结果将与同一样本的常规实验室测试产生的结果进行比较，以评估方法之间的灵敏度、特异性和一致性水平。 鉴于 mNGS 可能比常规方法更敏感，mNGS 结果也将由参与该项目的临床微生物学家与其他常规诊断（正交）测试进行评估，其中可能包括其他实验室测试、放射学和整体临床对患者的评估。
2. 还将评估和记录 mNGS 测试的临床影响：对于每个 mNGS 结果，临床微生物学家将评估 mNGS 结果对患者整体评估和管理的临床影响。