Evaluierung eines mNGS-Workflows zur Infektionsdiagnose mit Oxford Nanopore Sequencing.

Die diagnostische Mikrobiologie hat traditionell die Kultivierung von Organismen zur Diagnose einer Infektion umfasst, was zeitaufwändig, unempfindlich für schwer zu züchtende Organismen und durch eine vorherige antimikrobielle Therapie beeinträchtigt ist. Molekulare Diagnostik, überwiegend in Form von Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT), z. PCR, überwinden einige dieser Einschränkungen und werden jetzt weitverbreitet und zunehmend verwendet. NAAT-basierte Tests sind jedoch dadurch eingeschränkt, dass sie nur in der Lage sind, eine kleine Anzahl vorspezifizierter Organismen nachzuweisen, und können begrenzte oder gar keine Informationen über die Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln liefern.

Die metagenomische Sequenzierung der nächsten Generation (mNGS) funktioniert durch die direkte Sequenzierung aller Nukleinsäuren in einer mikrobiologischen Probe und ermöglicht so die Identifizierung aller Mikroorganismen, die in ausreichender Menge vorhanden sind, zusammen mit dem Potenzial, auf antimikrobielle Empfindlichkeitsmuster basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von zu schließen relevante Gene. Im Gegensatz zu NAAT ist keine Vorabspezifikation von Zielpathogenen erforderlich, sodass mNGS das Potenzial hat, wichtige Pathogene zu identifizieren, auf die anderweitig möglicherweise nicht getestet wurde. Wirtssequenzen (menschliche Sequenzen) sind ebenfalls in der Probe vorhanden und werden daher aus der Analyse entfernt, indem entweder verhindert wird, dass sie sequenziert werden, oder indem sie während der anfänglichen Analyseschritte gelöscht werden.

mNGS ist daher in der Lage, die Einschränkungen sowohl der kulturbasierten als auch der NAAT-basierten Infektionsdiagnose zu überwinden, mit dem Potenzial, eine schnelle Diagnose mit einem höheren Detailgrad der antimikrobiellen Empfindlichkeit anzubieten, die weniger davon beeinflusst wird, ob der Organismus lebensfähig/kultivierbar ist. Die schnelle Infektionsdiagnostik kann die Patientenversorgung erheblich verbessern, wodurch eine entsprechend zielgerichtete antimikrobielle Therapie zeitnah eingeleitet (oder beendet werden kann, wenn z. B. ein viraler Erreger identifiziert wird). Dies ist angesichts der anhaltenden globalen Zunahme von Antibiotikaresistenzen von besonderer Bedeutung. Die schnelle Diagnose mit mNGS kann auch den Bedarf an mehreren anderen Untersuchungslinien reduzieren. Es gibt wahrscheinlich bestimmte Patientengruppen, bei denen diese Technologie besonders gezielt eingesetzt werden kann, um maximalen Nutzen zu erzielen, entweder aufgrund der Schnelligkeit der Ergebnisse oder der Fähigkeit, Infektionen zu diagnostizieren, die möglicherweise nicht klinisch vermutet oder mit Standardverfahren erkannt wurden. In der Untersuchungsabteilung wurden kürzlich mehrere Fälle beobachtet, in denen Patienten aufgrund von Verzögerungen bei der Diagnose sehr schlechte Ergebnisse hatten, bei denen mNGS das Potenzial gehabt hätte, ihre Ergebnisse deutlich zu verbessern. Es gibt auch potenzielle Vorteile auf Bevölkerungsebene, wie z. B. die Verringerung der Exposition der Bevölkerung gegenüber Antibiotika mit übermäßigem Breitbandspektrum, die schnelle Erkennung und Überwachung übertragbarer Krankheiten, die möglicherweise eine Reaktion der öffentlichen Gesundheit erfordern, und die Beschleunigung einer angemessenen Behandlung und des Patientenflusses durch eine bereits überlastetes Krankenhaussystem. mNGS hat auch die Fähigkeit, neue Krankheitserreger zu erkennen. Beispielsweise war die schnelle Identifizierung und Verbreitung von Informationen in Bezug auf SARS-CoV-2 auf die Verfügbarkeit schneller „agnostischer“ Sequenzierungstechnologien zurückzuführen.

Die Sequenzierung der nächsten Generation war in der Regel zu teuer, um als diagnostischer Test an vorderster Front eingesetzt zu werden, da ihre Verwendung auf größere forschungsnahe Einrichtungen beschränkt war. Die Nanoporensequenzierung (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) bietet jedoch jetzt eine relativ kostengünstige Option mit geringem Platzbedarf und der Fähigkeit, schnell eine große Menge an Sequenzdaten zu generieren, was sie zu einer potenziell praktikablen Option für die diagnostische Mikrobiologie an vorderster Front macht Labore. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Verwendung der Nanoporensequenzierung für mNGS. Eine Reihe von Veröffentlichungen haben über seine Verwendung in der klinischen Diagnostik berichtet, und es wird bereits in einer Reihe von Einrichtungen des Gesundheitswesens im Ausland verwendet

. Kontinuierliche Qualitätsverbesserung (QI) durch die Bewertung neuer diagnostischer Assays ist ein äußerst wichtiger Bestandteil der klinischen Labormedizin. Dementsprechend sind die Forscher daran interessiert, den Einsatz von mNGS in ihrem Labor als QI-Initiative zu evaluieren, um den diagnostischen Service zu verbessern, die Sensitivität infektionsdiagnostischer Tests zu erhöhen und bestehende diagnostische Standardverfahren mit mNGS zu vergleichen. Die Forscher planen, dies in Form einer externen Bewertung vorzunehmen, wobei Proben von den Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) für mNGS-Tests an das Institute of Environmental Sciences and Research (ESR) weitergeleitet würden. ESR verfügt über vorhandenes Fachwissen in den Bereichen Sequenzierung und Bioinformatik und hat bereits mNGS-Fähigkeiten entwickelt, diese jedoch noch nicht umfassend an echten Patientenproben evaluiert. Die erste Bewertung würde bei ESR erfolgen, mit dem Ziel, einen Arbeitsablauf zu erstellen, der bei WSCL verwendet werden könnte.

Probenauswahl und Weiterleitung von WSCL an ESR

1. Restproben, die im Rahmen der routinemäßigen Patientenversorgung entnommen und zum Zweck der Infektionsdiagnose an das WSCL-Mikrobiologielabor geschickt wurden, werden verwendet. Es ist im Labor gängige Praxis, dass der Mikrobiologe zusätzliche (unaufgeforderte) Tests an bestimmten klinischen Proben arrangiert, um den Diagnoseprozess zu optimieren, einschließlich der Überweisung von Proben an ein externes Labor wie ESR. Diese Bewertung würde einem ähnlichen Verfahren folgen.
2. Die Proben werden am WSCL von dem/den am Projekt beteiligten klinischen Mikrobiologen identifiziert. Eine Vielzahl von Probenarten wird ausgewertet. Die spezifischen Probentypen, die bei der Bewertung bewertet werden, variieren im Laufe der Bewertung, je nachdem, wie gut der mNGS-Workflow bei verschiedenen Probentypen funktioniert. Zunächst werden Proben von normalerweise sterilen Stellen und solchen mit potenziell den größten positiven Auswirkungen auf die Patientenversorgung ausgewählt (z. Liquor, Gelenkflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Blut), gefolgt von Proben aus unsterilen Stellen (z. Sputum, Urin, Wundflüssigkeiten), wenn die ersten Ergebnisse ermutigend sind.
3. WSCL verarbeitet mikrobiologische Proben für die gesamten DHB-Regionen Capital & Coast und Hutt Valley, sodass die Proben von Patienten aus diesen Regionen bezogen werden. Die Mehrheit der Proben stammt von Krankenhauspatienten und nicht aus der Gemeinde. Es werden Proben aus einer Vielzahl unterschiedlicher klinischer Fachrichtungen ausgewertet, einschließlich Augmented-Care-Einheiten, z. sowohl Erwachsenen- als auch Neugeborenen-Intensivstationen und allgemeine Stationspatienten.

Stichprobengröße 1. Für diese Bewertung wurde keine spezifische Stichprobengröße berechnet, da die Gesamtzahl der getesteten Proben davon abhängt, wie viel Verfeinerung des mNGS-Testverfahrens erforderlich ist, und die Bewertung wahrscheinlich ein fortlaufender Prozess sein muss. Die Ermittler haben eine maximale Stichprobengröße von 400 festgelegt.

mNGS-Methodik

1. Klinische Proben werden zur Anreicherung von Bakterienzellen unter Verwendung von mit Poly-Lysin funktionalisierten SPRI-Magnetperlen (Solid Phase Reversible Immobilization) verarbeitet. Wirts- (menschliche) DNA wird durch differentielle Lyse und Nukleasebehandlung abgereichert.
2. Die gesamte Nukleinsäure wird aus den verarbeiteten Proben unter Verwendung von im Handel erhältlichen DNA-Extraktionskits extrahiert.
3. Das ONT-Schnellsequenzierungskit wird verwendet, um die resultierende DNA zu sequenzieren.
4. Um potenzielle Krankheitserreger in der Probe zu identifizieren, werden alle generierten nicht-menschlichen Sequenzen taxonomisch auf Artenebene klassifiziert, indem ein schneller Minimierer-basierter ungefährer Zuordnungsalgorithmus gegen kundenspezifische Krankheitserregerdatenbanken verwendet wird.

Vermeidung der Genomsequenzierung des Wirts (Mensch) Robuste Prozesse, die mehrere verschiedene veröffentlichte Strategien umfassen, werden eingeführt, um die Möglichkeit einer unbeabsichtigten Sequenzierung des menschlichen Genoms zu vermeiden.

1. Reduzierung der Wirts-DNA in der Probe:

   A. Die Anreicherung von Bakterienzellen und die chemische Abreicherung von Wirts-DNA während der ersten Probenverarbeitungsphase des Protokolls wird die erste Maßnahme sein, um die Sequenzierung menschlicher DNA zu vermeiden, indem die Menge an Wirts-DNA in der Probe reduziert wird.

2. Auswerfen der Wirts-DNA aus dem Sequenzer:

   A. Der zweite Filter zur Reduzierung der Hostsequenzierung ist die Verwendung der ONT-API „Read Until“. Dieser Prozess verhindert automatisch, dass vordefinierte DNA-Sequenzen in den Detektor gelangen, indem die Bewegungsrichtung des Moleküls durch den Detektor innerhalb von weniger als einer Sekunde umgekehrt wird, wodurch verhindert wird, dass Wirtsmoleküle in voller Länge sequenziert werden. Angesichts der Rohfehlerrate der Sequenzdaten tragen alle kurzen Host-Lesevorgänge, die diesen Filter passieren, unzureichende Informationen, um analysiert zu werden.

3. Hostsequenzen löschen:

   A. Der letzte Schritt, um zu vermeiden, dass die Wirtssequenz einer Analyse ausgesetzt wird, ist das automatische und dauerhafte Löschen aller verbleibenden menschlichen Sequenzdaten, während sie erzeugt werden, bevor der Datenstrom in den Analyseschritt eintritt.

4. Mapping-Sequenzen nur gegen mikrobielle Datenbanken:

   1. In dem sehr unwahrscheinlichen Fall, dass die Wirtssequenz die oben genannten Schritte besteht, besteht ein weiterer Sicherheitsschritt darin, dass alle Sequenzen nur gegen mikrobielle Datenbanken kartiert werden. Dies bedeutet, dass menschliche Sequenzen keine Übereinstimmung erzeugen würden und somit nicht Teil der Analyse wären.

Berichterstattung über Ergebnisse

1. Die Ergebnisse werden von ESR direkt an WSCL über die gleichen sicheren Wege gemeldet, die für andere Referenztests verwendet werden, die ESR für WSCL durchführt.
2. Die Ergebnisse werden von dem/den am Projekt beteiligten klinischen Mikrobiologen überprüft, damit eine Bewertung ihrer klinischen Relevanz vorgenommen werden kann, bevor die Ergebnisse den klinischen Teams zur Verfügung gestellt werden.
3. Die Ergebnisse werden in das WSCL-Laborinformationssystem eingegeben, damit sie dem klinischen Team gemeldet werden können. Dem Textbericht wird ein Kommentar beigefügt, in dem erklärt wird, dass die Ergebnisse mit mNGS generiert wurden, das sich noch in der Auswertung befindet, und der Mikrobiologe wird die Ergebnisse direkt mit dem klinischen Team besprechen, wenn das Ergebnis möglicherweise unsicher ist.

Auswertung der Ergebnisse

1. Die Ergebnisse der parallelen mNGS-Tests werden im Laufe der Zeit mit den Ergebnissen verglichen, die durch routinemäßige Labortests an derselben Probe erzielt wurden, um die Sensitivität, Spezifität und den Grad der Übereinstimmung zwischen den Methoden zu bewerten. Da mNGS möglicherweise empfindlicher ist als Routinemethoden, werden die mNGS-Ergebnisse auch von den am Projekt beteiligten klinischen Mikrobiologen im Vergleich zu anderen routinemäßigen diagnostischen (orthogonalen) Tests bewertet, die andere Labortests, Radiologie und die gesamte Klinik umfassen könnten Einschätzung des Patienten.
2. Die klinischen Auswirkungen des mNGS-Tests werden ebenfalls bewertet und aufgezeichnet: Für jedes mNGS-Ergebnis nehmen die klinischen Mikrobiologen eine Bewertung hinsichtlich der klinischen Auswirkungen vor, die das mNGS-Ergebnis auf die Gesamtbeurteilung und Behandlung des Patienten hatte.