Egy mNGS-munkafolyamat értékelése fertőzésdiagnózishoz Oxford nanopórus szekvencia segítségével.

A diagnosztikai mikrobiológia hagyományosan élőlények tenyésztését alkalmazza a fertőzés diagnosztizálására, ami időigényes, érzéketlen a nehezen termeszthető szervezetekre, és az előzetes antimikrobiális terápia veszélyezteti. Molekuláris diagnosztika, túlnyomórészt nukleinsav-amplifikációs tesztek (NAAT) formájában, pl. A PCR leküzdött néhány ilyen korlátot, és mára széles körben elterjedt és egyre inkább elterjedt. A NAAT-alapú tesztek azonban korlátozottak, mivel csak kis számú előre meghatározott organizmust képesek kimutatni, és az antimikrobiális érzékenységre vonatkozó információkat csak nem képesek nyújtani.

A metagenomikus következő generációs szekvenálás (mNGS) úgy működik, hogy a mikrobiológiai mintában lévő összes nukleinsavat közvetlenül szekvenálja, így lehetővé teszi az összes olyan mikroorganizmus azonosítását, amely elegendő mennyiségben van jelen, valamint az antimikrobiális érzékenységi mintázatok megléte vagy hiánya alapján. releváns gének. A NAAT-tól eltérően nincs szükség a megcélzott kórokozó(k) előzetes specifikációjára, így az mNGS képes azonosítani azokat a fontos kórokozókat, amelyeket egyébként esetleg nem teszteltek volna. Gazda (humán) szekvenciák is jelen lesznek a mintában, ezért kikerülnek az analízisből azáltal, hogy megakadályozzák a szekvenálásukat, vagy törlik őket a kezdeti elemzési lépések során.

Az mNGS ezért képes leküzdeni mind a tenyészeten alapuló, mind a NAAT-alapú fertőzésdiagnózis korlátait, gyors diagnosztikát kínálva az antimikrobiális érzékenység részletesebb szintjével, amelyet kevésbé befolyásol az, hogy a szervezet életképes/tenyészthető-e. A gyors fertőzésdiagnosztika képes jelentősen javítani a betegellátást, így a megfelelően célzott antimikrobiális terápia azonnal megkezdhető (vagy leállítható, ha például vírusos kórokozót azonosítanak). Ez különösen fontos az antimikrobiális rezisztencia globális növekedése miatt. Az mNGS-szel végzett gyors diagnosztika csökkentheti a több más vizsgálati irány szükségességét is. Valószínűleg vannak olyan betegcsoportok, ahol ez a technológia különösen a maximális haszon céljára irányulhat akár az eredmények gyorsasága, akár az olyan fertőzések diagnosztizálásának képessége miatt, amelyek klinikailag nem gyaníthatóak vagy standard eljárásokkal kimutathatók. A nyomozói osztályon a közelmúltban számos olyan esetet észleltek, amikor a betegek nagyon rossz eredményeket értek el a késedelmes diagnózis miatt, ahol az mNGS jelentősen javíthatta volna eredményeiket. Potenciális előnyökkel járhat a lakosság szintjén is, mint például a lakosság túlságosan széles spektrumú antibiotikumoknak való kitettségének csökkentése, a fertőző betegségek gyors azonosítása és felügyelete, amelyek közegészségügyi választ igényelhetnek, valamint a megfelelő kezelés és a betegek áramlásának felgyorsítása már zsúfolt kórházi rendszer. Az mNGS képes új kórokozók kimutatására is. Például a SARS-CoV-2-vel kapcsolatos információk gyors azonosítása és terjesztése a gyors „agnosztikus” szekvenálási technológiák elérhetőségének köszönhető.

A következő generációs szekvenálás jellemzően túl drága volt ahhoz, hogy élvonalbeli diagnosztikai tesztként használhassák, mivel a nagyobb kutatással foglalkozó intézményekre korlátozódik. Mindazonáltal a nanopórusos szekvenálás (Oxford Nanopore Technologies [ONT]) ma már viszonylag olcsó megoldást kínál, kis fizikai helyigénnyel és nagy mennyiségű szekvenciaadat gyors generálására alkalmas lehetőséggel, így potenciálisan életképes megoldás a frontvonalbeli diagnosztikai mikrobiológia számára. laboratóriumok. Mint ilyen, jelentős érdeklődés mutatkozik a nanopórusos szekvenálás alkalmazása iránt az mNGS-hez. Számos publikáció számolt be a klinikai diagnosztikában való használatáról, és már számos egészségügyi intézményben használják külföldön.

. A folyamatos minőségjavítás (QI) az új diagnosztikai vizsgálatok értékelésén keresztül a klinikai laboratóriumi gyógyászat kritikus fontosságú eleme. Ezzel összhangban a kutatók a diagnosztikai szolgáltatás fejlesztése, a fertőzésdiagnosztikai vizsgálatok érzékenységének növelése és a meglévő standard diagnosztikai eljárások mNGS-szel való összehasonlítása érdekében QI kezdeményezésként kívánják értékelni az mNGS használatát laboratóriumukban. A kutatók ezt egy külső értékelés formájában tervezik elvégezni, amelynek során a Wellington Southern Community Laboratories (WSCL) mintáit továbbítják a Környezettudományi és Kutatóintézethez (ESR) mNGS-vizsgálat céljából. Az ESR meglévő szakértelemmel rendelkezik a szekvenálás és a bioinformatika területén, és már kifejlesztette az mNGS képességet, de nem értékelte ki átfogóan valódi betegmintákon. A kezdeti értékelés az ESR-nél történne, azzal a céllal, hogy olyan munkafolyamatot hozzanak létre, amely használható lenne a WSCL-nél.

Mintaválasztás és áttétel a WSCL-ről az ESR-re

1. A rutin betegellátás részeként gyűjtött és a fertőzés diagnosztizálása céljából a WSCL mikrobiológiai laboratóriumába küldött maradékmintákat használjuk fel. A laboratóriumban általánosan elfogadott gyakorlat, hogy a mikrobiológus további (nem kért) vizsgálatokat szervez bizonyos klinikai mintákon a diagnosztikai folyamat optimalizálása érdekében, beleértve a minták külső laboratóriumba, például ESR-be való utalását. Ez az értékelés hasonló eljárást követne.
2. A mintákat a WSCL-ben a projektben részt vevő klinikai mikrobiológus(ok) azonosítják. Különféle mintatípusokat értékelnek. Az értékelés során értékelendő konkrét mintatípusok az értékelés során változnak, attól függően, hogy az mNGS munkafolyamat milyen jól működik a különböző mintatípusokon. Kezdetben a normál steril helyekről származó mintákat és azokat, amelyek potenciálisan a legnagyobb pozitív hatással vannak a betegellátásra (pl. agy-gerincvelői folyadék, ízületi folyadék, pleurális folyadék, vér), majd nem steril helyekről vett minták (pl. köpet, vizelet, sebfolyadék), ha a kezdeti eredmények biztatóak.
3. A WSCL a teljes Capital & Coast és a Hutt Valley DHB régióban dolgoz fel mikrobiológiai mintákat, így a mintákat ezekben a régiókban lévő betegektől szerzik be. A minták többsége kórházi betegektől származik, nem pedig közösségi alapú. Számos különböző klinikai szakterületről származó mintákat értékelnek, beleértve a kiterjesztett gondozási egységeket, pl. felnőtt és újszülött intenzív osztályokon, valamint általános osztályon lévő betegeken egyaránt.

Mintaméret 1. Ehhez az értékeléshez nem számítottak ki konkrét mintaméretet, mivel a vizsgált minták teljes száma attól függ, hogy mennyi finomításra van szükség az mNGS-tesztelési folyamaton, és az értékelésnek valószínűleg folyamatosnak kell lennie. A kutatók 400-ban határozták meg a maximális mintanagyságot.

mNGS módszertan

1. A klinikai mintákat polilizinnel funkcionalizált szilárd fázisú reverzibilis immobilizációs (SPRI) mágneses gyöngyökkel dolgozzák fel, hogy bakteriális sejteket dúsítsanak. A gazdaszervezet (humán) DNS-ét differenciális lízis és nukleázkezelés segítségével kimerítik.
2. A feldolgozott mintákból a teljes nukleinsavat a kereskedelemben kapható DNS extrakciós készletek segítségével vonják ki.
3. Az eredményül kapott DNS szekvenálásához ONT gyors szekvenáló készletet használunk.
4. A potenciális kórokozó fajok azonosítása érdekében a mintában az összes generált nem humán szekvenciát taxonómiailag fajszintre kell besorolni egy gyors minimalizáló alapú közelítő leképezési algoritmus segítségével, testreszabott kórokozó-adatbázisok alapján.

A gazdaszervezet (humán) genom szekvenálásának elkerülése A nem szándékos emberi genom szekvenálás lehetőségének elkerülése érdekében robusztus folyamatokat vezetnek be, amelyek számos különböző publikált stratégiát foglalnak magukban.

1. A gazda DNS redukálása a mintában:

   a. A protokoll kezdeti mintafeldolgozási szakaszában a baktériumsejtek feldúsítása és a gazda DNS kémiai kimerülése lesz az első lépés a humán DNS szekvenálásának elkerülésében a mintában lévő gazda-DNS mennyiségének csökkentésével.

2. Gazda DNS eltávolítása a szekvenálóból:

   a. A második szűrő a gazdagép sorrendjének csökkentésére az ONT „Olvasásig” API-t fogja használni. Ez a folyamat automatikusan megakadályozza, hogy előre meghatározott DNS-szekvenciák lépjenek be a detektorba azáltal, hogy egy másodpercnél rövidebb időn belül megfordítja a molekula detektoron keresztüli haladási irányát, megakadályozva ezzel a teljes hosszúságú gazdamolekulák szekvenálását. Tekintettel a sorozatadatok nyers hibaarányára, a szűrőn átmenő rövid gazdagép-olvasások nem tartalmaznak elegendő információt az elemzéshez.

3. Gazdaszekvenciák törlése:

   a. Az utolsó lépés annak elkerülésére, hogy a gazdaszekvencia elemzésnek legyen kitéve, az összes maradék emberi szekvencia adat automatikus és végleges törlése az előállítás során, mielőtt az adatfolyam belépne az elemzési lépésbe.

4. Szekvenciák leképezése csak mikrobiális adatbázisokhoz:

   1. Abban a nagyon valószínűtlen esetben, ha a gazdaszekvencia átmegy a fenti lépéseken, egy további biztonsági lépés az, hogy bármely szekvenciát csak a mikrobiális adatbázisokhoz kell leképezni. Ez azt jelenti, hogy egyetlen emberi szekvencia sem hozna létre egyezést, így nem képezné részét az elemzésnek.

Eredmények jelentése

1. Az eredményeket az ESR közvetlenül a WSCL-nek jelenti, ugyanazon a biztonságos útvonalon, amelyet más referenciatesztekhez használnak, mint amelyeket az ESR a WSCL esetében végez.
2. Az eredményeket a projektben részt vevő klinikai mikrobiológus(ok) felülvizsgálják, hogy klinikai relevanciájuk értékelését elvégezhessék, mielőtt az eredményeket a klinikai csoportok rendelkezésére bocsátanák.
3. Az eredmények bekerülnek a WSCL laboratóriumi információs rendszerébe, hogy jelenteni lehessen őket a klinikai csoportnak. A szöveges jelentéshez egy megjegyzést mellékelünk, amely elmagyarázza, hogy az eredményeket mNGS segítségével hozták létre, amelynek értékelése még folyamatban van, és a mikrobiológus közvetlenül megbeszéli a klinikai csoporttal az eredményeket, ha az eredmény körül bármilyen bizonytalanság merül fel.

Az eredmények értékelése

1. A párhuzamos mNGS-vizsgálat eredményeit idővel összehasonlítják az ugyanazon a mintán végzett rutin laboratóriumi vizsgálatok eredményeivel, hogy értékeljék a módszerek érzékenységét, specificitását és egyezési szintjét. Tekintettel arra, hogy az mNGS potenciálisan érzékenyebb, mint a rutin módszerek, az mNGS eredményeit a projektben részt vevő klinikai mikrobiológus(ok) más rutin diagnosztikai (ortogonális) vizsgálatokkal is értékelni fogják, amelyek magukban foglalhatnak más laboratóriumi vizsgálatokat, radiológiát és általános klinikai vizsgálatokat. a beteg értékelése.
2. Az mNGS-teszt klinikai hatását is felmérik és rögzítik: minden mNGS-eredménynél a klinikai mikrobiológus(ok) értékelik, hogy az mNGS-eredmény milyen klinikai hatást gyakorolt ​​a beteg általános értékelésére és kezelésére.