骨移植における骨形成のエンハンサーとしての自家間葉系幹細胞培養由来シグナル伝達分子

1. 目的と仮説

   以前に報告された研究に基づいて、トランスレーショナル アプローチに従って、移植部位で局所的に作用する生理的濃度の培養自己増殖因子およびサイトカインに関連するパラクリン効果が、より迅速かつ/またはより効率的な細胞応答を促進し、その結果、より重要な細胞応答を誘導する可能性があるという仮説。 /より速い骨形成が考慮されました。 合成代用骨に加えられたこれらの分子の存在は、局所的な細胞動員（走化性）、増殖、分化、および骨タンパク質合成に関して積極的に作用する可能性があります。 また、通常、腫瘍形成性、免疫原性、および以前に報告された細胞脱分化現象の観点から、細胞のex vivo操作に関連する、従来の組織工学的細胞移植化合物に関連する再発性の生物学的危険は、このプロセスの細胞要素の除外によって軽減されます。 、一部のレポートでは、人工的に培養されると予測不可能な有糸分裂挙動を示すと考えられているためです。 本研究は、主任研究者による前臨床研究に続くこのトランスレーショナル研究をさらに拡張することを目的としており、濃縮自家細胞培養培地（CM ) およびヒドロキシルアパタイト/β-リン酸三カルシウムベースの合成骨代替物 (HP/β-TCP セラミック)。 具体的な目的には、コンピューター断層撮影法 (CBCT) による新たに形成された石灰化組織の密度の分析、特定の免疫組織化学的骨形成マーカー (RT-PCR) の発現、および組織形態学的骨量評価が含まれます。 分割口研究モデルでは、CM の有無にかかわらず HP/β-TCP 移植後の骨形成が分析され、異なる時点で比較および定量化されます。

2. 材料および方法

2.1-研究デザイン

現在の調査の研究デザインとして、前向き分割口無作為対照臨床試験が選択されました。 研究倫理委員会によるプロトコルの承認および臨床試験への登録後.gov プラットフォームでは、CONSORT ガイドラインに従って、ブラジルの PUCRS の健康と生命科学の学校の補綴歯科で上顎の口腔リハビリテーションを求める 20 人の連続した患者が、現在の調査に参加するよう招待されます。

2.2 - 脂肪形成術およびヒト脂肪幹細胞 (hASC) の採取/培養。

hASCs の収穫のために、腹部脂肪形成術の手順が提案され、署名されたインフォームド コンセントに従って実行されます。 局所麻酔とともに、静脈内鎮静および経口カテーテルによる酸素補給下で、標準的な外科的脂肪形成術が行われます。 前述のように、この脂肪吸引材料から、25 ～ 30 ml の脂肪が 50 ml のファルコン チューブに移されます。 次に、脂肪を遠心分離 (430 Å g 10 分) によって洗浄し、上部の脂肪層を新しい Falcon チューブに移し、そこで同量のコラゲナーゼ溶液を混合物に加え、水中で 37°C でインキュベートします。バス。 遠心分離後、上部の脂肪層を捨て、上清を取り除きます。 hASCを含む残りの細胞ペレットは、15mlの培地で再懸濁されます。 15mlの温かい培地を加えた後、細胞懸濁液をT175培養フラスコに移します。 hASC は、37°C​​、5% CO2 の加湿環境で培養されます。 次に、細胞ペレットを温かい培地に再懸濁し、新しい細胞培養フラスコに播種します。

2.3 - 濃縮培地 (CM) の調製と分析

幹細胞の培養とCM作製は、再生医療等製品GMP認定施設で行います。 最初に、3 番目の通路で分離された hASCs の表面抗原プロファイルは、フローサイトメトリーによって特徴付けられます。 CD73、CD90、CD105、および CD44 マーカーの存在と、CD34、CD45、CD11b、CD19、および HLA-DR の非存在を評価して、国際細胞療法学会のプロトコルで推奨されているように、目的の細胞表現型を確認します。[ 次に、これらの細胞のサンプルは、製造元の指示に従って染色 (アリザリンレッド S) によっても特徴付けられます。 細胞増殖およびCMは、標準的な幹細胞培養プロトコルに従って生成されます。 臨床使用前に、CM は、細菌、真菌、またはマイコプラズマによる汚染だけでなく、B 型および C 型肝炎、ヒト免疫不全、ヒト T 細胞白血病ウイルスなどのウイルスへの感染についても検査されます。 次に、以前に示唆されたように、CM は適切に低温保存され、臨床応用に送られます (最大 6 時間)。

2.4 - 上顎洞床挙上手順

IV鎮静および経口カテーテルによる酸素補給下で、局所麻酔とともに、外側上顎洞壁にドリルで穴を開けて上顎骨を内部移植します。 慎重な解放と上昇を伴う洞膜解剖も行われます。 コンピューターで生成された乱数による術前のランダム化を使用して、各患者の試験副鼻腔と対照副鼻腔を決定します。 試験部位の上顎洞の骨床は、10 ～ 15 ml の CM と混合された 4 ～ 5 g の合成代用骨 (BoneCeramic™ 1 ～ 2 mm) で補強されます。 対照部位には、10～15mlの生理食塩水に埋め込まれた同様の量の代用骨が与えられます。 患者は、手術の2時間後に病院施設から解放されます。 彼らは、術後の衛生と摂食行動について指導を受けます。 すべての患者は、術後の抗生物質および抗炎症療法を受けます。

2.5 - インプラント埋入と骨生検の採取

6 か月の治癒後、インプラントの埋入は、インプラント メーカーが推奨する通常の外科的プロトコルに従います。 局所麻酔下で、必要に応じて切開を解放しながら、歯槽頂中部の直線切開と全層フラップを行います。 次に、16:1 コントラアングルをサージカル ユニットに取り付け、トレフィン バー (Ø 3mm) を使用して、上顎の左右両側で、第 2 小臼歯、第 1 および第 2 大臼歯領域に対応する移植領域を生検します。 (患者あたり n = 06 サイト)、以前に作成されたアクリル樹脂外科用ステントによって導かれます。 次に、骨生検を 2 つのセグメントに分割します。1 つは組織学的分析用に 4% ホルムアルデヒド溶液に保存し、もう 1 つは RT-PCR 分析用に RNALater を含むエッペンドルフ バイアルに保存します。 次に、メーカーが推奨するインプラント外科用バーの順序に従って、患者ごとに 6 ～ 8 個のインプラントを配置します。 挿入時の初期安定性の登録は、手動トルクレンチと 3 つのグループに分類されます。 その後、治癒アバットメントが配置され、非吸収性縫合糸材料を使用して創傷閉鎖が行われます。すべてのインプラントに 6 か月の 1 段階治癒プロトコルが採用されます。

2.6 - CBCT 画像解析

高解像度 CBCT 画像は、治療プロトコルの一部として 3 つの異なる時点で取得されます。つまり、術前の骨移植 [ベースライン]、90 [T1] および 180 [T2] 日 (インプラント配置術前) を意味します。手術前の手術計画と手術後の骨形成の評価の両方を目指しています。 以前に提案された米国骨鉱物研究協会 (ASBMR) の推奨に従って、形態計測学的骨パラメーターが 3D 分析で計算され、統計分析を使用して、海綿骨を 3 つの骨に区別することを目的とした最適なパラメーターの組み合わせが特定されます。カテゴリ: (i) 緩い骨構造に関連する疎、(ii) 構造の整った骨梁に関連する中間、および (iii) 骨梁間のスペースがほとんどない巨大な骨領域に関連する密な骨タイプ。

2.7 - 組織学的および組織形態学的分析

インプラント埋入時に移植片生検を除去した後、対照および試験骨部位を含む骨ブロックを形成し、5% HNO3 で脱灰します。 ブロックは段階的なアルコールシリーズで脱水され、キシレンで透明になり、樹脂に埋め込まれます。 その後、樹脂は 10 h の UV ライト チャンバーで重合されます。 ダイヤモンドマイクロソーを使用して、各ブロックから合計 3 つの厚さ 3 μm のスライスを、外側部分から 50、100、および 150 μm で各試験片の長軸に対して横方向に研磨します。 この後、ヘマトキシリン-エオジン (HE)、Azur II、およびパラロサニリンを用いた通常の染色を行い、HP/β-TCP 粒子と新たに形成された骨を区別します。 顕微鏡分析は、デジタル カメラに接続された光学実体顕微鏡を使用して 24 倍の倍率で実行されます。 画像解析は、ImageJ® ソフトウェアを使用して実行されます。

2.8 - リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)

RNA 抽出のための収集された移植片生検の準備に続いて、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 分析を適用して、アルカリホスファターゼ、血管内皮増殖因子、オステオネクチン、オステオポンチン、および 1 型コラーゲンを定量化します。