Molécules de signalisation dérivées de la culture de cellules souches mésenchymateuses autogènes en tant qu'amplificateurs de la formation osseuse dans la greffe osseuse

1. Objectifs et hypothèse

   Basée sur des études précédemment rapportées et suivant une approche translationnelle, une hypothèse selon laquelle l'effet paracrine lié aux facteurs de croissance autogènes cultivés et aux cytokines à des concentrations physiologiques agissant localement dans les sites greffés pourrait favoriser une réponse cellulaire plus rapide et/ou plus efficace et par conséquent induire une /une formation osseuse plus rapide a été envisagée. La présence de ces molécules ajoutées aux substituts osseux synthétiques pourrait agir positivement en termes de recrutement cellulaire local (chimiotaxie), de prolifération, de différenciation et de synthèse des protéines osseuses. De plus, les risques biologiques récurrents impliqués dans les composés conventionnels de greffe cellulaire issus de l'ingénierie tissulaire, généralement liés à la manipulation ex vivo des cellules en termes de tumorigénicité, d'immunogénicité et du phénomène de dédifférenciation cellulaire précédemment signalé, seraient atténués par l'exclusion de l'élément cellulaire de ce processus. , car ils sont considérés par certains rapports comme présentant un comportement mitotique imprévisible une fois cultivés artificiellement. La présente étude vise à étendre cette investigation translationnelle suite aux études précliniques menées par l'investigateur principal, en proposant un essai clinique contrôlé randomisé prospectif sur les bénéfices possibles associés à l'application d'un composé de greffe osseuse issue de l'ingénierie tissulaire contenant un milieu de culture cellulaire autogène concentré (CM ) et un substitut osseux synthétique à base d'hydroxylapatite/bêta-phosphate tricalcique (céramique HP/β-TCP). Les objectifs spécifiques comprennent des analyses sur la densité du tissu calcifié nouvellement formé par tomodensitométrie (CBCT), l'expression de marqueurs immunohistochimiques spécifiques de la formation osseuse (RT-PCR) et l'évaluation histomorphométrique de la quantité osseuse. Dans un modèle d'étude à bouche divisée, la formation osseuse résultante après une greffe HP/β-TCP avec et sans CM sera analysée, comparée et quantifiée à différents moments.

2. Matériels et méthodes

2.1- Conception de l'étude

Un essai clinique contrôlé randomisé prospectif en bouche divisée a été choisi comme plan d'étude pour la présente enquête. Après approbation du protocole par le comité d'éthique de la recherche et inscription sur le site Clinical Trials.gov plate-forme, conformément aux directives CONSORT, 20 patients consécutifs qui cherchent une réhabilitation buccale maxillaire au Département de dentisterie prothétique de l'École des sciences de la santé et de la vie - PUCRS, Brésil, seront invités à participer à la présente enquête.

2.2 - Lipoplastie et récolte/culture de cellules souches adipeuses humaines (hASC).

Pour le prélèvement des hASC, une procédure de lipoplastie abdominale sera proposée et réalisée suite à un consentement éclairé signé. Sous sédation intraveineuse et libération d'oxygène supplémentaire avec un cathéter buccal, ainsi qu'une anesthésie locale, une technique de lipoplastie chirurgicale standard sera réalisée. Comme décrit précédemment, à partir de ce matériel de liposuccion, 25 à 30 ml de graisse seront transférés dans un tube Falcon de 50 ml. La graisse sera ensuite lavée par centrifugation (430Å~g 10 min), étant la couche de graisse supérieure transférée dans un nouveau tube Falcon, où un volume égal de solution de collagénase sera ajouté au mélange et incubé à 37°C dans une eau bain. Après centrifugation, la couche de graisse supérieure sera jetée et le surnageant retiré. Le culot cellulaire restant contenant les hASC sera remis en suspension avec 15 ml de milieu de culture. Après avoir ajouté 15 ml de milieu de culture chaud, la suspension cellulaire sera transférée dans un flacon de culture T175. Les hASC seront incubés dans un environnement humidifié à 37°C et 5% de CO2. Ensuite, le culot cellulaire sera remis en suspension dans un milieu de culture chaud et ensemencé dans de nouveaux flacons de culture cellulaire.

2.3 - Préparation et analyse du milieu de culture concentré (MC)

La culture de cellules souches et la préparation de CM seront effectuées dans une installation certifiée GMP pour les produits de médecine régénérative. Dans un premier temps, les profils antigéniques de surface des hASC isolées au troisième passage seront caractérisés par cytométrie en flux. La présence des marqueurs CD73, CD90, CD105 et CD44 et l'absence de CD34, CD45, CD11b, CD19 et HLA-DR seront évaluées pour confirmer le phénotype cellulaire souhaité tel que recommandé par les protocoles de l'International Society of Cellular Therapy.[ Ensuite, un échantillon de ces cellules sera également caractérisé par coloration (Alizarin Red S) conformément aux instructions du fabricant. L'expansion cellulaire et le CM seront générés selon les protocoles standard de culture de cellules souches. Avant l'utilisation clinique, le CM sera examiné non seulement pour une contamination par des bactéries, des champignons ou des mycoplasmes, mais également pour une infection par des virus, notamment l'hépatite B et C, l'immunodéficience humaine et les virus de la leucémie à cellules T humaines. Ensuite, le CM sera correctement stocké au frais et envoyé à l'application clinique (jusqu'à 6 heures), pour éviter la dénaturation/inactivation à long terme des molécules de signalisation présentes, comme suggéré précédemment.

2.4 - Procédure d'élévation du plancher sinusal maxillaire

Sous sédation intraveineuse et libération d'oxygène supplémentaire avec un cathéter oral, ainsi qu'une anesthésie locale, l'os maxillaire sera greffé en interne en perçant un accès dans la paroi latérale du sinus maxillaire. Une dissection de la membrane sinusienne avec une libération et une élévation soigneuses sera également effectuée. La randomisation préopératoire par des nombres aléatoires générés par ordinateur sera utilisée pour déterminer les sinus de test et de contrôle pour chaque patient. Le plancher osseux du sinus maxillaire sur le site de test sera augmenté de 4 à 5 g d'un substitut osseux synthétique (BoneCeramic™ 1-2 mm) mélangé à 10 à 15 ml de CM. Le site de contrôle recevra une quantité similaire de substitut osseux intégré dans 10 à 15 ml de solution saline. Les patients sortiront de l'hôpital 2h après la chirurgie. Ils seront formés à l'hygiène postopératoire et au comportement alimentaire. Tous les patients recevront des traitements antibiotiques et anti-inflammatoires postopératoires.

2.5 - Pose d'implants et prélèvement de biopsies osseuses

Après 6 mois de cicatrisation, la pose de l'implant suivra les protocoles chirurgicaux de routine recommandés par le fabricant de l'implant. Sous anesthésie locale, une incision linéaire à mi-crête et un lambeau de pleine épaisseur seront réalisés avec des incisions de libération chaque fois que nécessaire. Ensuite, avec un contre-angle 16:1 fixé à un bloc opératoire et une fraise trépan (Ø 3mm), la zone greffée correspondant aux régions 2ème prémolaire, 1ère et 2ème molaire sera biopsiée des deux côtés droit et gauche du maxillaire (n=06 sites par patient), guidé par un stent chirurgical en résine acrylique préalablement réalisé. Les biopsies osseuses seront ensuite divisées en deux segments, où l'un sera stocké dans une solution de formaldéhyde à 4 % pour l'analyse histologique et l'autre dans des flacons Eppendorf avec RNALater pour l'analyse RT-PCR. Ensuite, la séquence de fraises chirurgicales implantaires recommandée par le fabricant sera suivie pour la pose de 6 à 8 implants par patient. L'enregistrement de la stabilité primaire à l'insertion sera effectué à la fois par une clé dynamométrique manuelle et classé en trois groupes. Un pilier de cicatrisation sera ensuite placé et la fermeture de la plaie sera réalisée avec un matériau de suture non résorbable. Un protocole de cicatrisation en une étape de 6 mois sera adopté pour tous les implants.

2.6 - Analyse d'images CBCT

Des images CBCT haute résolution seront obtenues à trois moments différents dans le cadre du protocole de traitement, c'est-à-dire à la greffe osseuse préopératoire [baseline], 90 [T1] et 180 [T2] jours (placement de l'implant préopératoire), visant à la fois la planification chirurgicale préopératoire et l'évaluation postopératoire de la formation osseuse. Les paramètres osseux morphométriques seront calculés en analyse 3D selon les recommandations de l'American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) comme proposé précédemment, et l'analyse statistique sera utilisée pour identifier les meilleures combinaisons de paramètres visant à différencier l'os trabéculaire en trois os catégories : (i) clairsemé lié à une structure osseuse lâche, (ii) intermédiaire lié à un os trabéculaire bien structuré, et (iii) types osseux denses liés à une zone osseuse massive avec peu d'espace entre les trabécules.

2.7 - Analyses histologiques et histomorphométriques

Après le retrait des biopsies de greffe lors de la pose de l'implant, les blocs osseux contenant les sites osseux de contrôle et de test seront façonnés et décalcifiés avec 5 % de HNO3. Les blocs seront déshydratés dans une série d'alcools gradués, clarifiés avec du xylène et intégrés dans de la résine. Ensuite, la résine sera polymérisée dans une chambre à lumière UV pendant 10h. À l'aide d'une micro-scie diamantée, un total de trois tranches de 3 μm d'épaisseur de chaque bloc seront meulées transversalement à chaque axe long de l'échantillon à 50, 100 et 150 μm de leur partie externe. Après cela, une coloration de routine avec de l'hématoxyline-éosine (HE), de l'Azur II et de la pararosaniline sera effectuée dans le but de différencier les particules HP/β-TCP de l'os nouvellement formé. L'analyse microscopique sera effectuée à un grossissement de 24X à l'aide d'un stéréomicroscope optique connecté à un appareil photo numérique. L'analyse des images sera effectuée à l'aide du logiciel ImageJ®.

2.8 - Réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR)

Suite à la préparation des biopsies de greffe collectées pour l'extraction d'ARN, une analyse en temps réel de la réaction en chaîne par transcriptase inverse-polymérase (RT-PCR) sera appliquée pour quantifier la phosphatase alcaline, le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, l'ostéonectine, l'ostéopontine et le collagène de type 1.