自体间充质干细胞培养衍生的信号分子作为骨移植中骨形成的增强剂

1. 目标和假设

   基于先前报道的研究并遵循转化方法，假设与培养的自体生长因子和细胞因子相关的旁分泌效应在生理浓度下局部作用于移植部位，可能会促进更快和/或更有效的细胞反应，从而诱导更显着的/考虑了更快的骨形成。 添加到合成骨替代物中的这些分子的存在可能在局部细胞募集（趋化性）、增殖、分化和骨蛋白合成方面发挥积极作用。 此外，常规组织工程细胞移植化合物中反复出现的生物危害，通常与细胞在致瘤性、免疫原性和先前报道的细胞去分化现象方面的离体操作有关，可以通过排除该过程的细胞元素来减轻, 因为它们被一些报告认为一旦人工培养就会出现不可预测的有丝分裂行为。 本研究旨在进一步扩展主要研究者临床前研究后的转化研究，提出一项前瞻性随机对照临床试验，研究与应用含有浓缩自体细胞培养基 (CM) 的组织工程骨移植化合物相关的可能益处) 和基于羟基磷灰石/β-磷酸三钙的合成骨替代物（HP/β-TCP 陶瓷）。 具体目标包括通过计算机断层扫描 (CBCT) 分析新形成的钙化组织的密度、特定免疫组织化学骨形成标记物 (RT-PCR) 的表达和组织形态学骨量评估。 在分口研究模型中，将在不同时间点分析、比较和量化 HP/β-TCP 移植有和没有 CM 后产生的骨形成。

2. 材料和方法

2.1- 研究设计

选择一项前瞻性分口随机对照临床试验作为本调查的研究设计。 在研究伦理委员会批准协议并在临床试验中注册后.gov 平台，根据 CONSORT 指南，连续 20 名在巴西 PUCRS 健康与生命科学学院修复牙科寻求上颌口腔康复的患者将被邀请参加本次调查。

2.2 - 脂肪成形术和人类脂肪干细胞 (hASCs) 收获/培养。

对于 hASCs 收获，将在签署知情同意书后提出并执行腹部脂肪成形术。 在静脉镇静和通过口腔导管补充氧气释放以及局部麻醉的情况下，将进行标准的外科脂肪成形术技术。 如前所述，从这种吸脂材料中，25 至 30 毫升的脂肪将被转移到 50 毫升的 Falcon 管中。 然后通过离心（430Å~g 10 分钟）洗涤脂肪，将上层脂肪转移到新的 Falcon 试管中，将等体积的胶原酶溶液加入混合物中并在 37°C 的水中孵育洗澡。 离心后，弃去上层脂肪层，去除上清液。 剩余的含有 hASC 的细胞沉淀将用 15 ml 培养基重悬。 加入15ml温热培养基后，将细胞悬液转移至T175培养瓶中。 hASC 将在 37°C 和 5% CO2 的加湿环境中孵育。 然后，将细胞沉淀重新悬浮在温暖的培养基中并接种到新的细胞培养瓶中。

2.3 - 浓缩培养基 (CM) 的制备和分析

干细胞培养和 CM 制备将在 GMP 认证的再生医学产品设施中进行。 首先，第三代分离的 hASC 的表面抗原谱将通过流式细胞术进行表征。 将评估 CD73、CD90、CD105 和 CD44 标记物的存在以及 CD34、CD45、CD11b、CD19 和 HLA-DR 的缺失，以确认所需的细胞表型，如国际细胞治疗协会的方案所建议的那样。 [ 然后，这些细胞的样本也将根据制造商的说明通过染色（茜素红 S）进行表征。 将按照标准干细胞培养方案生成细胞扩增和 CM。 在临床使用之前，不仅要检查 CM 是否被细菌、真菌或支原体污染，还要检查病毒感染情况，包括乙型和丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒和人类 T 细胞白血病病毒。 然后，CM 将被适当冷藏并送往临床应用（最多 6 小时），以避免如前所述，现有信号分子的长期变性/失活。

2.4 - 上颌窦底抬高程序

在通过口腔导管进行静脉镇静和补充氧气释放以及局部麻醉的情况下，将通过在上颌窦外侧壁钻孔进行内部移植上颌骨。 还将进行仔细释放和抬高的窦膜解剖。 通过计算机生成的随机数进行术前随机化，将用于确定每位患者的测试和对照鼻窦。 测试部位上颌窦的骨底将用 4 至 5 克合成骨替代物（BoneCeramic™ 1-2 毫米）与 10 至 15 毫升 CM 混合来增强。 对照部位将接受嵌入 10 至 15 毫升盐水溶液中的相似数量的骨替代物。 患者将在手术后 2 小时出院。 他们将接受术后卫生和饮食行为方面的指导。 所有患者将接受术后抗生素和抗炎治疗。

2.5 - 种植体植入和骨活检采集

愈合 6 个月后，种植体植入将遵循种植体制造商推荐的常规手术方案。 在局麻下，行牙槽嵴中线形切口和全层皮瓣，必要时松开切口。 然后，使用连接到手术装置的 16:1 反角和环钻 (Ø 3mm)，在上颌骨的左右两侧对对应于第二前磨牙、第一和第二磨牙区域的移植区域进行活检（每位患者 n = 06 个部位），由先前制作的丙烯酸树脂手术支架引导。 然后将骨活检分成两部分，其中一部分将储存在 4% 甲醛溶液中用于组织学分析，另一部分将储存在装有 RNALater 的 Eppendorf 小瓶中用于 RT-PCR 分析。 然后，将按照制造商推荐的植入手术车针顺序为每位患者植入 6 至 8 个植入物。 插入时的初级稳定性记录将通过手动扭矩扳手完成并分为三组。 然后将放置一个愈合基台，并使用不可吸收的缝合材料进行伤口闭合。所有种植体都将采用 6 个月的一阶段愈合方案。

2.6 - CBCT图像分析

作为治疗方案的一部分，将在三个不同的时间点获得高分辨率 CBCT 图像，这意味着在术前植骨 [基线]、90 [T1] 和 180 [T2] 天（术前植入物放置），针对骨形成的术前手术计划和术后评估。 根据美国骨骼和矿物研究协会 (ASBMR) 先前提出的建议，将在 3D 分析中计算形态测量骨骼参数，并使用统计分析来确定旨在将小梁骨区分为三骨的最佳参数组合类别：(i) 稀疏-与松散的骨结构相关，(ii) 中间相关与结构良好的骨小梁，以及 (iii) 密骨类型-与大块骨区域相关，小梁之间的空间很小。

2.7 - 组织学和组织形态学分析

在种植体植入时去除移植活组织检查后，将使用 5% HNO3 对包含对照和测试骨部位的骨块进行整形和脱钙。 这些块将在梯度酒精系列中脱水，用二甲苯澄清并包埋在树脂中。 然后，树脂将在紫外光室中聚合 10 小时。 使用金刚石微锯，将每个块的总共三个 3 μm 厚的切片横向研磨到每个试样长轴，距其外部部分 50、100 和 150 μm。 在此之后，将用苏木精-伊红 (HE)、Azur II 和副玫瑰苯胺进行常规染色，以区分 HP/β-TCP 颗粒和新形成的骨骼。 显微镜分析将使用连接到数码相机的光学体视显微镜以 24 倍放大率进行。 将使用 ImageJ® 软件进行图像分析。

2.8 - 实时聚合酶链反应 (RT-PCR)

在准备好收集的用于 RNA 提取的移植活检后，将应用实时逆转录酶-聚合酶链反应 (RT-PCR) 分析来量化碱性磷酸酶、血管内皮生长因子、骨连接素、骨桥蛋白和 1 型胶原蛋白。