Autogene mesenchymale stamcelcultuur-afgeleide signaalmoleculen als versterkers van botvorming bij bottransplantatie

1. Doelstellingen en hypothese

   Gebaseerd op eerder gerapporteerde studies en volgens een translationele benadering, zou een hypothese dat het paracriene effect gekoppeld aan gekweekte autogene groeifactoren en cytokines bij fysiologische concentraties die lokaal inwerken op getransplanteerde plaatsen, een snellere en/of efficiëntere celrespons kunnen bevorderen en bijgevolg een significantere /snellere botvorming werd overwogen. De aanwezigheid van deze moleculen toegevoegd aan synthetische botvervangers zou een positief effect kunnen hebben op lokale celrekrutering (chemotaxis), proliferatie, differentiatie en boteiwitsynthese. Ook zouden terugkerende biologische risico's die betrokken zijn bij conventionele weefselgemanipuleerde celtransplantaatverbindingen, meestal gekoppeld aan de ex vivo manipulatie van cellen in termen van tumorigeniciteit, immunogeniciteit en het eerder gerapporteerde fenomeen van celdedifferentiatie, worden verzacht door de uitsluiting van het celelement van dit proces. , aangezien ze volgens sommige rapporten onvoorspelbaar mitotisch gedrag vertonen als ze eenmaal kunstmatig zijn gekweekt. De huidige studie heeft tot doel dit translationele onderzoek verder uit te breiden na preklinische studies door de hoofdonderzoeker, waarbij een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde klinische studie wordt voorgesteld over de mogelijke voordelen die samenhangen met de toepassing van een weefselgemanipuleerde bottransplantaatsamenstelling die geconcentreerd autogeen celgekweekt medium bevat (CM ) en een op hydroxylapatiet/beta-tricalciumfosfaat gebaseerd synthetisch botsubstituut (HP/β-TCP-keramiek). Specifieke doelstellingen omvatten analyses van de dichtheid van het nieuw gevormde verkalkte weefsel door middel van computertomografie (CBCT's), expressie van specifieke immunohistochemische markers voor botvorming (RT-PCR) en histomorfometrische evaluatie van de bothoeveelheid. In een split-mouth studiemodel zal de resulterende botvorming na HP/β-TCP-transplantatie met en zonder CM worden geanalyseerd, vergeleken en gekwantificeerd op verschillende tijdstippen.

2. Materialen en methodes

2.1- Onderzoeksopzet

Een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde klinische studie met gesplitste mond werd gekozen als onderzoeksopzet voor dit onderzoek. Na goedkeuring van het protocol door de Research Ethics Committee en registratie op clinical trials.gov platform, volgens de CONSORT-richtlijnen, zullen 20 opeenvolgende patiënten die maxillaire orale revalidatie zoeken bij de afdeling Prothetische Tandheelkunde van de School of Health and Life Sciences - PUCRS, Brazilië, worden uitgenodigd om deel te nemen aan het huidige onderzoek.

2.2 - Lipoplastie en oogsten/kweken van menselijke vetstamcellen (hASC's).

Voor het oogsten van hASC's zal een abdominale lipoplastiekprocedure worden voorgesteld en uitgevoerd na een ondertekende geïnformeerde toestemming. Onder intraveneuze sedatie en aanvullende zuurstofafgifte met een orale katheter, samen met lokale anesthesie, zal een standaard chirurgische lipoplastiektechniek worden uitgevoerd. Zoals eerder beschreven, wordt van dit liposuctiemateriaal 25 tot 30 ml vet overgebracht in een Falcon-buis van 50 ml. Het vet wordt vervolgens gewassen door centrifugeren (430Å~g 10 min), waarbij de bovenste vetlaag wordt overgebracht naar een nieuwe Falcon-buis, waar een gelijk volume collagenase-oplossing aan het mengsel wordt toegevoegd en bij 37°C in een waterbad wordt geïncubeerd. bad. Na centrifugeren wordt de bovenste vetlaag weggegooid en het supernatant verwijderd. De resterende celpellet met de hASC's wordt geresuspendeerd met 15 ml kweekmedium. Na toevoeging van 15 ml warm kweekmedium wordt de celsuspensie overgebracht in een T175 kweekfles. De hASC's worden geïncubeerd in een bevochtigde omgeving bij 37°C en 5% CO2. Vervolgens wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd in warm kweekmedium en uitgezaaid in nieuwe celkweekflessen.

2.3 - Bereiding en analyse van geconcentreerd kweekmedium (CM).

Stamcelkweek en CM-voorbereiding zullen worden uitgevoerd in een GMP-gecertificeerde faciliteit voor producten voor regeneratieve geneeskunde. In eerste instantie zullen de oppervlakte-antigeenprofielen van geïsoleerde hASC's bij de derde passage worden gekarakteriseerd door flowcytometrie. De aanwezigheid van CD73-, CD90-, CD105- en CD44-markers en de afwezigheid van CD34, CD45, CD11b, CD19 en HLA-DR zal worden beoordeeld om het gewenste celfenotype te bevestigen, zoals aanbevolen door de protocollen van de International Society of Cellular Therapy.[ Vervolgens wordt een monster van deze cellen ook gekenmerkt door kleuring (Alizarin Red S) in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Celexpansie en CM zullen worden gegenereerd volgens standaard stamcelcultuurprotocollen. Vóór klinisch gebruik zal CM niet alleen worden onderzocht op besmetting met bacteriën, schimmels of mycoplasma's, maar ook op infectie met virussen, waaronder hepatitis B en C, humane immunodeficiëntie en humane T-celleukemievirussen. Vervolgens wordt CM op de juiste manier koel bewaard en naar klinische toepassing gestuurd (tot 6 uur), om langdurige denaturatie/inactivering van aanwezige signaalmoleculen te voorkomen, zoals eerder werd gesuggereerd.

2.4 - Procedure voor verhoging van de vloer van de sinus maxillaris

Onder IV-sedatie en aanvullende zuurstofafgifte met een orale katheter, samen met lokale anesthesie, wordt het maxillaire bot intern geënt door een opening in de laterale maxillaire sinuswand te boren. Sinusmembraandissectie met zorgvuldige release en elevatie zal ook worden uitgevoerd. Preoperatieve randomisatie door computergegenereerde willekeurige getallen zal worden gebruikt om de test- en controlebijholten voor elke patiënt te bepalen. De benige bodem van de sinus maxillaris op de testplaats wordt vergroot met 4 tot 5 g van een synthetische botvervanger (BoneCeramic™ 1-2 mm) gemengd met 10 tot 15 ml CM. De controleplaats krijgt een vergelijkbare hoeveelheid botvervanger ingebed in 10 tot 15 ml zoutoplossing. Patiënten worden 2 uur na de operatie uit het ziekenhuis ontslagen. Ze worden geïnstrueerd in postoperatieve hygiëne en eetgedrag. Alle patiënten krijgen postoperatieve antibiotische en ontstekingsremmende therapieën.

2.5 - Plaatsing van implantaten en oogsten van botbiopten

Na 6 maanden genezing volgt de plaatsing van het implantaat de routinematige chirurgische protocollen zoals aanbevolen door de fabrikant van het implantaat. Onder plaatselijke verdoving wordt een mid-crestale lineaire incisie en een flap over de volledige dikte uitgevoerd, waarbij indien nodig de incisies worden losgelaten. Vervolgens, met een 16:1 hoekstuk bevestigd aan een chirurgische eenheid en een trephineboor (Ø 3 mm), zal het getransplanteerde gebied dat overeenkomt met de gebieden van de 2e premolaar, 1e en 2e molaar biopsie ondergaan aan zowel de rechter- als de linkerkant van de bovenkaak (n=06 plaatsen per patiënt), geleid door een eerder gemaakte chirurgische stent van acrylhars. Botbiopten worden vervolgens verdeeld in twee segmenten, waarvan één wordt bewaard in 4% formaldehyde-oplossing voor histologische analyse en de andere in Eppendorf-flesjes met RNALater voor RT-PCR-analyse. Vervolgens wordt de door de fabrikant aanbevolen volgorde van chirurgische implantaatboren gevolgd voor de plaatsing van 6 tot 8 implantaten per patiënt. Registratie van de primaire stabiliteit bij het inbrengen wordt gedaan met zowel een handmatige momentsleutel als ingedeeld in drie groepen. Er wordt dan een healing abutment geplaatst en de wond wordt gesloten met niet-resorbeerbaar hechtmateriaal. Voor alle implantaten wordt een genezingsprotocol in één fase van zes maanden toegepast.

2.6 - CBCT-beeldanalyse

CBCT-beelden met hoge resolutie zullen op drie verschillende tijdstippen worden verkregen als onderdeel van het behandelingsprotocol, d.w.z. pre-operatief bottransplantaat [baseline], 90 [T1] en 180 [T2] dagen (implantaatplaatsing pre-operatief), gericht op zowel preoperatieve planning als postoperatieve evaluatie van de botvorming. De morfometrische botparameters zullen worden berekend in 3D-analyse volgens de aanbevelingen van de American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) zoals eerder voorgesteld, en statistische analyse zal worden gebruikt om de beste parametercombinaties te identificeren die gericht zijn op het differentiëren van trabeculair bot in drie bot categorieën: (i) dun gerelateerd aan een losse botstructuur, (ii) intermediair gerelateerd aan een goed gestructureerd trabeculair bot, en (iii) dichte bottypen gerelateerd aan een enorm botgebied met weinig ruimte tussen de trabeculae.

2.7 - Histologische en histomorfometrische analyses

Na verwijdering van transplantaatbiopten bij plaatsing van het implantaat, worden botblokken met de controle- en testbotplaatsen gevormd en ontkalkt met 5% HNO3. De blokken zullen uitdrogen in een gesorteerde alcoholreeks, verhelderen met xyleen en worden ingebed in hars. Vervolgens wordt de hars gedurende 10 uur gepolymeriseerd in een UV-lichtkamer. Met behulp van een diamant-microzaag worden in totaal drie plakjes van 3 μm dik van elk blok dwars op de lengteas van elk monster geslepen op 50, 100 en 150 μm van hun externe gedeelte. Hierna zal routinematige kleuring met hematoxyline-eosine (HE), Azur II en Pararosaniline worden uitgevoerd om onderscheid te maken tussen HP/β-TCP-deeltjes en nieuw gevormd bot. Microscopische analyse zal worden uitgevoerd bij een vergroting van 24x met behulp van een optische stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van de ImageJ®-software.

2.8 - Realtime polymerasekettingreactie (RT-PCR)

Na de voorbereiding van de verzamelde transplantaatbiopten voor RNA-extractie, zal real-time reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (RT-PCR) analyse worden toegepast om alkalische fosfatase, vasculaire endotheliale groeifactor, osteonectine, osteopontine en type 1 collageen te kwantificeren.