Moléculas de señalización derivadas del cultivo de células madre mesenquimales autógenas como potenciadores de la formación ósea en injertos óseos

1. Objetivos e Hipótesis

   Con base en estudios informados previamente y siguiendo un enfoque traslacional, se planteó la hipótesis de que el efecto paracrino vinculado a factores de crecimiento autógenos cultivados y citocinas en concentraciones fisiológicas que actúan localmente en los sitios injertados podría promover una respuesta celular más rápida y/o más eficiente y, en consecuencia, inducir una respuesta celular más significativa. /Se consideró una formación ósea más rápida. La presencia de estas moléculas añadidas a sustitutos óseos sintéticos podría actuar positivamente en términos de reclutamiento celular local (quimiotaxis), proliferación, diferenciación y síntesis de proteínas óseas. Además, los peligros biológicos recurrentes involucrados en los compuestos de injerto celular de ingeniería tisular convencionales, generalmente vinculados a la manipulación ex vivo de células en términos de tumorigenicidad, inmunogenicidad y el fenómeno de desdiferenciación celular informado anteriormente, se mitigarían mediante la exclusión del elemento celular de este proceso. , ya que algunos informes consideran que presentan un comportamiento mitótico impredecible una vez cultivadas artificialmente. El presente estudio tiene como objetivo ampliar aún más esta investigación traslacional siguiendo los estudios preclínicos realizados por el investigador principal, proponiendo un ensayo clínico prospectivo, aleatorizado y controlado sobre los posibles beneficios asociados con la aplicación de un compuesto de injerto óseo diseñado por ingeniería tisular que contiene un medio de cultivo de células autógenas concentrado (CM ) y un sustituto óseo sintético a base de hidroxilapatita/fosfato beta-tricálcico (cerámica HP/β-TCP). Los objetivos específicos incluyen análisis de la densidad del tejido calcificado recién formado mediante tomografía computarizada (CBCT), expresión de marcadores inmunohistoquímicos específicos de formación ósea (RT-PCR) y evaluación histomorfométrica de la cantidad ósea. En un modelo de estudio de boca dividida, la formación ósea resultante después del injerto de HP/β-TCP con y sin CM se analizará, comparará y cuantificará en diferentes momentos.

2. Materiales y métodos

2.1- Diseño del estudio

Se eligió un ensayo clínico prospectivo controlado aleatorio de boca dividida como diseño de estudio para la presente investigación. Después de la aprobación del protocolo por parte del Comité de Ética en Investigación y registro en Clinical Trials.gov plataforma, siguiendo las directrices CONSORT, 20 pacientes consecutivos que buscan rehabilitación oral maxilar en el Departamento de Odontología Protésica de la Facultad de Ciencias de la Salud y la Vida - PUCRS, Brasil, serán invitados a participar en la presente investigación.

2.2 - Recolección/cultivo de células madre adiposas humanas (hASC) y lipoplastia.

Para la recolección de hASC, se propondrá y realizará un procedimiento de lipoplastia abdominal después de un consentimiento informado firmado. Bajo sedación intravenosa y liberación de oxígeno suplementario con un catéter oral, junto con anestesia local, se realizará una técnica de lipoplastia quirúrgica estándar. Como se ha descrito anteriormente, de este material de liposucción se transferirán de 25 a 30 ml de grasa a un tubo Falcon de 50 ml. Luego, la grasa se lavará por centrifugación (430 Å~g 10 min), y la capa de grasa superior se transferirá a un tubo Falcon nuevo, donde se agregará un volumen igual de solución de colagenasa a la mezcla y se incubará a 37 °C en agua. baño. Después de la centrifugación, se descartará la capa superior de grasa y se eliminará el sobrenadante. El sedimento celular restante que contiene las hASC se resuspenderá con 15 ml de medio de cultivo. Después de agregar 15 ml de medio de cultivo tibio, la suspensión celular se transferirá a un matraz de cultivo T175. Las hASC se incubarán en un ambiente húmedo a 37 °C y 5 % de CO2. Luego, el sedimento celular se resuspenderá en un medio de cultivo tibio y se sembrará en nuevos frascos de cultivo celular.

2.3 - Preparación y análisis del medio de cultivo concentrado (CM)

El cultivo de células madre y la preparación de CM se realizarán en una instalación certificada por GMP para productos de medicina regenerativa. En primer lugar, los perfiles de antígenos de superficie de las hASC aisladas en el tercer paso se caracterizarán mediante citometría de flujo. Se evaluará la presencia de los marcadores CD73, CD90, CD105 y CD44 y la ausencia de CD34, CD45, CD11b, CD19 y HLA-DR para confirmar el fenotipo celular deseado según lo recomendado por los protocolos de la Sociedad Internacional de Terapia Celular.[ Luego, una muestra de estas células también se caracterizará por tinción (Alizarin Red S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expansión celular y el CM se generarán siguiendo los protocolos estándar de cultivo de células madre. Antes del uso clínico, el CM se examinará no solo para detectar contaminación con bacterias, hongos o micoplasmas, sino también para detectar infecciones con virus, incluidos los de la hepatitis B y C, la inmunodeficiencia humana y la leucemia de células T humanas. Luego, el CM se almacenará adecuadamente en frío y se enviará a la aplicación clínica (hasta 6 horas), para evitar la desnaturalización/inactivación a largo plazo de las moléculas de señalización presentes, como se sugirió anteriormente.

2.4 - Procedimiento de elevación del suelo del seno maxilar

Bajo sedación intravenosa y liberación de oxígeno suplementario con un catéter oral, junto con anestesia local, el hueso maxilar se injertará internamente mediante la perforación de un acceso en la pared lateral del seno maxilar. También se realizará una disección de la membrana sinusal con liberación y elevación cuidadosas. Se utilizará la aleatorización preoperatoria mediante números aleatorios generados por computadora para determinar los senos de prueba y de control para cada paciente. El piso óseo del seno maxilar en el sitio de prueba se aumentará con 4 a 5 g de un sustituto óseo sintético (BoneCeramic™ 1-2 mm) mezclado con 10 a 15 ml de CM. El sitio de control recibirá una cantidad similar de sustituto óseo incluido en 10 a 15 ml de solución salina. Los pacientes serán dados de alta de las instalaciones del hospital 2 horas después de la cirugía. Se les instruirá en la higiene postoperatoria y en la conducta alimentaria. Todos los pacientes recibirán terapias antibióticas y antiinflamatorias postoperatorias.

2.5 - Colocación de implantes y obtención de biopsias óseas

Después de 6 meses de cicatrización, la colocación del implante seguirá los protocolos quirúrgicos de rutina recomendados por el fabricante del implante. Bajo anestesia local, se realizará una incisión lineal en la cresta media y un colgajo de espesor total con incisiones de liberación cuando sea necesario. Luego, con un contra-ángulo 16:1 conectado a una unidad quirúrgica y una fresa de trépano (Ø 3 mm), el área injertada correspondiente a las regiones del 2° premolar, 1° y 2° molar será biopsiada en ambos lados derecho e izquierdo del maxilar. (n=06 sitios por paciente), guiados por un stent quirúrgico de resina acrílica previamente elaborado. Luego, las biopsias óseas se dividirán en dos segmentos, donde uno se almacenará en una solución de formaldehído al 4% para el análisis histológico y el otro en viales Eppendorf con RNALater para el análisis RT-PCR. Luego, se seguirá la secuencia de fresas quirúrgicas de implantes recomendada por el fabricante para la colocación de 6 a 8 implantes por paciente. El registro de la estabilidad primaria en la inserción se realizará mediante llave dinamométrica manual y se clasificará en tres grupos. Luego se colocará un pilar de cicatrización y se cerrará la herida con material de sutura no reabsorbible. Se adoptará un protocolo de cicatrización de una etapa de 6 meses para todos los implantes.

2.6 - Análisis de imágenes CBCT

Se obtendrán imágenes CBCT de alta resolución en tres momentos diferentes como parte del protocolo de tratamiento, es decir, en el injerto óseo preoperatorio [línea de base], 90 [T1] y 180 [T2] días (colocación del implante antes de la operación), apuntando tanto a la planificación quirúrgica preoperatoria como a la evaluación postoperatoria de la formación ósea. Los parámetros morfométricos del hueso se calcularán en análisis 3D de acuerdo con las recomendaciones de la Sociedad Estadounidense para la Investigación Ósea y Mineral (ASBMR) como se propuso anteriormente, y se usará el análisis estadístico para identificar las mejores combinaciones de parámetros con el objetivo de diferenciar el hueso trabecular en tres huesos. categorías: (i) escasa relacionada con una estructura ósea suelta, (ii) intermedia relacionada con un hueso trabecular bien estructurado y (iii) tipos de hueso denso relacionados con un área de hueso masivo con poco espacio entre las trabéculas.

2.7 - Análisis histológicos e histomorfométricos

Después de la extracción de las biopsias del injerto en la colocación del implante, los bloques óseos que contienen los sitios óseos de control y de prueba se moldearán y descalcificarán con HNO3 al 5 %. Los bloques se deshidratarán en una serie graduada de alcohol, se clarificarán con xileno y se incrustarán en resina. Luego, la resina se polimerizará en una cámara de luz ultravioleta durante 10 h. Usando una microsierra de diamante, un total de tres rebanadas de 3 μm de espesor de cada bloque se triturarán transversalmente al eje longitudinal de cada muestra a 50, 100 y 150 μm de su parte externa. Después de esto, se realizará la tinción de rutina con hematoxilina-eosina (HE), Azur II y Pararosanilina con el objetivo de diferenciar entre partículas de HP/β-TCP y hueso recién formado. El análisis microscópico se realizará con un aumento de 24X utilizando un microscopio estereoscópico óptico conectado a una cámara digital. El análisis de imágenes se realizará utilizando el software ImageJ®.

2.8 - Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR)

Después de la preparación de las biopsias de injerto recolectadas para la extracción de ARN, se aplicará el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en tiempo real para cuantificar la fosfatasa alcalina, el factor de crecimiento del endotelio vascular, la osteonectina, la osteopontina y el colágeno tipo 1.