Molecole di segnalazione derivate dalla coltura di cellule staminali mesenchimali autogene come potenziatori della formazione ossea nell'innesto osseo

1. Obiettivi e ipotesi

   Sulla base di studi precedentemente riportati e seguendo un approccio traslazionale, l'ipotesi che l'effetto paracrino legato a fattori di crescita autogeni in coltura e citochine a concentrazioni fisiologiche che agiscono localmente nei siti innestati potrebbe promuovere una risposta cellulare più rapida e/o più efficiente e di conseguenza indurre una più significativa /è stata considerata una formazione ossea più rapida. La presenza di queste molecole aggiunte ai sostituti ossei sintetici potrebbe agire positivamente in termini di reclutamento cellulare locale (chemiotassi), proliferazione, differenziamento e sintesi proteica ossea. Inoltre, i ricorrenti rischi biologici coinvolti nei tradizionali composti di innesto cellulare ingegnerizzati sui tessuti, solitamente legati alla manipolazione ex vivo delle cellule in termini di tumorigenicità, immunogenicità e il fenomeno di dedifferenziazione cellulare precedentemente riportato, sarebbero mitigati dall'esclusione dell'elemento cellulare di questo processo , poiché secondo alcuni rapporti presentano un comportamento mitotico imprevedibile una volta coltivate artificialmente. Il presente studio si propone di estendere ulteriormente questa indagine traslazionale a seguito di studi preclinici da parte del ricercatore principale, proponendo uno studio clinico prospettico randomizzato controllato sui possibili benefici associati all'applicazione di un composto di innesto osseo di ingegneria tissutale contenente mezzo concentrato di coltura cellulare autogena (CM ) e un sostituto osseo sintetico a base di idrossiapatite/beta-tricalcio fosfato (ceramica HP/β-TCP). Obiettivi specifici includono analisi sulla densità del tessuto calcificato neoformato mediante tomografia computerizzata (CBCT), espressione di marcatori immunoistochimici specifici di formazione ossea (RT-PCR) e valutazione istomorfometrica della quantità ossea. In un modello di studio split-mouth, la formazione ossea risultante dopo l'innesto HP/β-TCP con e senza CM sarà analizzata, confrontata e quantificata in diversi punti temporali.

2. Materiali e metodi

2.1- Progettazione dello studio

Come disegno dello studio per la presente indagine è stato scelto uno studio clinico controllato randomizzato prospettico split-mouth. Dopo l'approvazione del protocollo da parte del Research Ethics Committee e la registrazione presso il Clinical Trials.gov piattaforma, seguendo le linee guida CONSORT, 20 pazienti consecutivi che cercano riabilitazione orale mascellare presso il Dipartimento di Odontoiatria Protesica della Scuola di Scienze della Salute e della Vita - PUCRS, Brasile, saranno invitati a partecipare alla presente indagine.

2.2 - Raccolta/coltura di lipoplastica e cellule staminali adipose umane (hASCs).

Per la raccolta delle hASC, verrà proposta ed eseguita una procedura di lipoplastica addominale a seguito di un consenso informato firmato. Sotto sedazione endovenosa e rilascio di ossigeno supplementare con un catetere orale, insieme all'anestesia locale, verrà eseguita una tecnica chirurgica standard di lipoplastica. Come descritto in precedenza, da questo materiale per liposuzione verranno trasferiti da 25 a 30 ml di grasso in un tubo Falcon da 50 ml. Il grasso verrà quindi lavato mediante centrifugazione (430Å~g 10 min), essendo lo strato di grasso superiore trasferito in una nuova provetta Falcon, dove un volume uguale di soluzione di collagenasi verrà aggiunto alla miscela e incubato a 37°C in acqua bagno. Dopo la centrifugazione, lo strato di grasso superiore verrà scartato e il surnatante rimosso. Il restante pellet cellulare contenente le hASC sarà risospeso con 15 ml di terreno di coltura. Dopo aver aggiunto 15 ml di terreno di coltura caldo, la sospensione cellulare sarà trasferita in un pallone di coltura T175. Le hASC saranno incubate in un ambiente umidificato a 37°C e 5% CO2. Quindi, il pellet cellulare sarà risospeso in terreno di coltura caldo e seminato in nuove fiasche di coltura cellulare.

2.3 - Preparazione e analisi del terreno di coltura concentrato (CM).

La coltura di cellule staminali e la preparazione di CM saranno eseguite presso una struttura certificata GMP per prodotti di medicina rigenerativa. Inizialmente, i profili antigenici di superficie delle hASC isolate al terzo passaggio saranno caratterizzati mediante citometria a flusso. La presenza di marcatori CD73, CD90, CD105 e CD44 e l'assenza di CD34, CD45, CD11b, CD19 e HLA-DR saranno valutate per confermare il fenotipo cellulare desiderato come raccomandato dai protocolli della International Society of Cellular Therapy.[ Quindi, un campione di queste cellule sarà anche caratterizzato mediante colorazione (Alizarin Red S) secondo le istruzioni del produttore. L'espansione cellulare e CM saranno generati seguendo protocolli standard di coltura di cellule staminali. Prima dell'uso clinico, CM sarà esaminato non solo per la contaminazione da batteri, funghi o micoplasmi, ma anche per l'infezione da virus tra cui l'epatite B e C, l'immunodeficienza umana e i virus della leucemia a cellule T umane. Quindi, CM sarà opportunamente conservato in frigorifero e inviato all'applicazione clinica (fino a 6 ore), per evitare la denaturazione/inattivazione a lungo termine delle molecole di segnalazione presenti, come suggerito in precedenza.

2.4 - Procedura di rialzo del pavimento del seno mascellare

Sotto sedazione endovenosa e rilascio di ossigeno supplementare con un catetere orale, insieme all'anestesia locale, l'osso mascellare verrà innestato internamente perforando un accesso nella parete laterale del seno mascellare. Verrà inoltre eseguita la dissezione della membrana del seno con rilascio ed elevazione accurati. Verrà utilizzata la randomizzazione preoperatoria mediante numeri casuali generati dal computer per determinare il test e controllare i seni per ciascun paziente. Il pavimento osseo del seno mascellare nel sito del test sarà aumentato con 4-5 g di un sostituto osseo sintetico (BoneCeramic™ 1-2 mm) miscelato con 10-15 ml di CM. Il sito di controllo riceverà una quantità simile di sostituto osseo incorporato in 10-15 ml di soluzione salina. I pazienti verranno dimessi dalla struttura ospedaliera 2 ore dopo l'intervento. Saranno istruiti sull'igiene postoperatoria e sul comportamento alimentare. Tutti i pazienti riceveranno terapie antibiotiche e antinfiammatorie postoperatorie.

2.5 - Inserimento di impianti e prelievo di biopsie ossee

Dopo 6 mesi di guarigione, il posizionamento dell'impianto seguirà i protocolli chirurgici di routine come raccomandato dal produttore dell'impianto. In anestesia locale, verrà eseguita un'incisione lineare crestale media e un lembo a tutto spessore con incisioni di rilascio quando necessario. Quindi, con un contrangolo 16:1 collegato a un'unità chirurgica e una fresa per trapano (Ø 3 mm), l'area innestata corrispondente alle regioni del 2° premolare, 1° e 2° molare sarà biopsiata a destra e a sinistra della mascella (n=06 siti per paziente), guidati da uno stent chirurgico in resina acrilica precedentemente realizzato. Le biopsie ossee saranno quindi divise in due segmenti, dove uno sarà conservato in soluzione di formaldeide al 4% per l'analisi istologica e l'altro in vials Eppendorf con RNALater per l'analisi RT-PCR. Quindi, verrà seguita la sequenza delle frese chirurgiche implantari raccomandata dal produttore per il posizionamento da 6 a 8 impianti per paziente. La registrazione della stabilità primaria all'inserimento sarà effettuata sia con chiave dinamometrica manuale che classificata in tre gruppi. Verrà quindi posizionato un pilastro di guarigione e la chiusura della ferita sarà condotta con materiale di sutura non riassorbibile. Per tutti gli impianti verrà adottato un protocollo di guarigione in una fase di 6 mesi.

2.6 - Analisi delle immagini CBCT

Le immagini CBCT ad alta risoluzione saranno ottenute in tre diversi punti temporali come parte del protocollo di trattamento, ovvero all'innesto osseo preoperatorio [basale], 90 [T1] e 180 [T2] giorni (posizionamento dell'impianto preoperatorio), mirando sia alla pianificazione chirurgica preoperatoria che alla valutazione postoperatoria della formazione ossea. I parametri ossei morfometrici saranno calcolati in analisi 3D secondo le raccomandazioni dell'American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) come precedentemente proposto, e l'analisi statistica sarà utilizzata per identificare le migliori combinazioni di parametri con l'obiettivo di differenziare l'osso trabecolare in tre ossa categorie: (i) rado correlato a una struttura ossea sciolta, (ii) intermedio correlato a un osso trabecolare ben strutturato e (iii) tipi di osso denso correlati a un'area ossea massiccia con poco spazio tra le trabecole.

2.7 - Analisi istologiche ed istomorfometriche

Dopo la rimozione delle biopsie dell'innesto al momento del posizionamento dell'impianto, i blocchi ossei contenenti i siti ossei di controllo e test saranno modellati e decalcificati con HNO3 al 5%. I blocchi si disidrateranno in una serie graduata di alcool, si chiarificheranno con xilene e saranno incorporati nella resina. Quindi, la resina sarà polimerizzata in una camera di luce UV per 10 ore. Utilizzando una microsega diamantata, un totale di tre fette di 3 μm di spessore da ciascun blocco saranno molate trasversalmente all'asse lungo di ciascun campione a 50, 100 e 150 μm dalla loro porzione esterna. Successivamente, verrà eseguita la colorazione di routine con ematossilina-eosina (HE), Azur II e pararosanilina con l'obiettivo di differenziare tra particelle HP/β-TCP e osso neoformato. L'analisi microscopica sarà eseguita a 24 ingrandimenti utilizzando uno stereomicroscopio ottico collegato a una fotocamera digitale. L'analisi delle immagini verrà eseguita utilizzando il software ImageJ®.

2.8 - Reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR)

Dopo la preparazione delle biopsie raccolte per l'estrazione dell'RNA, verrà applicata l'analisi della reazione a catena della trascrittasi inversa-polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per quantificare la fosfatasi alcalina, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare, l'osteonectina, l'osteopontina e il collagene di tipo 1.