Autogene mesenkymale stamcellekultur-afledte signalmolekyler som forstærkere af knogledannelse ved knogletransplantation

1. Mål og hypotese

   Baseret i tidligere rapporterede undersøgelser og efter en translationel tilgang, kan en hypotese om, at den parakrine effekt forbundet med dyrkede autogene vækstfaktorer og cytokiner ved fysiologiske koncentrationer, der virker lokalt på transplanterede steder, fremme en hurtigere og/eller mere effektiv cellerespons og følgelig inducere en mere signifikant /hurtigere knogledannelse blev overvejet. Tilstedeværelsen af ​​disse molekyler tilføjet til syntetiske knogleerstatninger kan virke positivt med hensyn til lokal cellerekruttering (kemotaksi), proliferation, differentiering og knogleproteinsyntese. Tilbagevendende biologiske farer involveret i konventionelle vævsmanipulerede cellulære graftforbindelser, sædvanligvis forbundet med ex vivo manipulation af celler med hensyn til tumorigenicitet, immunogenicitet og det tidligere rapporterede celledifferentieringsfænomen, ville blive afbødet ved udelukkelse af celleelementet i denne proces , da de af nogle rapporter anses for at præsentere uforudsigelig mitotisk adfærd, når de først er blevet kunstigt dyrket. Nærværende undersøgelse har til formål at udvide denne translationelle undersøgelse yderligere efter prækliniske undersøgelser foretaget af hovedforskeren, der foreslår et prospektivt randomiseret kontrolleret klinisk forsøg på de mulige fordele forbundet med anvendelsen af ​​en vævsmanipuleret knogletransplantatforbindelse indeholdende koncentreret autogent celledyrket medium (CM ) og en hydroxylapatit/beta-tricalciumphosphat-baseret syntetisk knogleerstatning (HP/β-TCP keramik). Specifikke mål omfatter analyser af tætheden af ​​det nydannede forkalkede væv ved computertomografi (CBCT'er), ekspression af specifikke immunhistokemiske knogledannelsesmarkører (RT-PCR) og histomorfometrisk knoglekvantitetsevaluering. I en split-mouth studiemodel vil den resulterende knogledannelse efter HP/β-TCP-transplantation med og uden CM blive analyseret, sammenlignet og kvantificeret på forskellige tidspunkter.

2. Materialer og metoder

2.1- Studiedesign

Et prospektivt splitmundet randomiseret kontrolleret klinisk forsøg blev valgt som studiedesign for denne undersøgelse. Efter protokolgodkendelse af den forskningsetiske komité og registrering på clinical trials.gov platform, efter CONSORT-retningslinjer, vil 20 på hinanden følgende patienter, der søger maksillær oral rehabilitering ved Department of Prosthetic Dentistry ved School of Health and Life Sciences - PUCRS, Brasilien, blive inviteret til at deltage i denne undersøgelse.

2.2 - Lipoplastik og humane fedtstamceller (hASC'er) høst/kultur.

Til høst af hASC'er vil en abdominal lipoplastikprocedure blive foreslået og udført efter et underskrevet informeret samtykke. Under intravenøs sedation og supplerende iltfrigivelse med et oralt kateter vil der sammen med lokalbedøvelse blive udført en standard kirurgisk lipoplastikteknik. Som tidligere beskrevet, fra dette fedtsugende materiale, vil 25 til 30 ml fedt blive overført til et 50 ml Falcon-rør. Fedtet vil derefter blive vasket ved centrifugering (430Å~g 10 min), idet det øverste fedtlag overføres til et nyt Falcon-rør, hvor et lige så stort volumen kollagenaseopløsning vil blive tilsat til blandingen og inkuberet ved 37°C i vand. bad. Efter centrifugering vil det øverste fedtlag blive kasseret og supernatanten fjernet. Den resterende cellepellet, der indeholder hASC'erne, resuspenderes med 15 ml dyrkningsmedium. Efter tilsætning af 15 ml varmt dyrkningsmedium vil cellesuspensionen blive overført til en T175 dyrkningskolbe. hASC'erne vil blive inkuberet i et fugtigt miljø ved 37°C og 5% CO2. Derefter vil cellepelleten blive resuspenderet i varmt dyrkningsmedium og podet i nye cellekulturkolber.

2.3 - Forberedelse og analyse af koncentreret kulturmedium (CM).

Stamcellekultur og CM-forberedelse vil blive udført på et GMP-certificeret anlæg for regenerative medicinprodukter. Først vil overfladeantigenprofilerne af isolerede hASC'er ved tredje passage være karakteriseret ved flowcytometri. Tilstedeværelsen af ​​CD73, CD90, CD105 og CD44 markører og fraværet af CD34, CD45, CD11b, CD19 og HLA-DR vil blive vurderet for at bekræfte den ønskede cellefænotype som anbefalet af protokoller fra International Society of Cellular Therapy.[ Derefter vil en prøve af disse celler også blive karakteriseret ved farvning (Alizarin Red S) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Celleekspansion og CM vil blive genereret efter standard stamcelledyrkningsprotokoller. Før klinisk brug vil CM ikke kun blive undersøgt for kontaminering med bakterier, svampe eller mycoplasmas, men også for infektion med vira, herunder hepatitis B og C, human immundefekt og human T-celle leukæmivirus. Derefter vil CM blive korrekt afkølet og sendt til klinisk anvendelse (op til 6 timer), for at undgå langvarig denaturering/inaktivering af nuværende signalmolekyler, som tidligere foreslået.

2.4 - Procedure for hævning af gulv ved sinus maksillær sinus

Under IV-sedation og supplerende iltfrigivelse med et oralt kateter, sammen med lokalbedøvelse, vil maksillærknoglen blive transplanteret internt ved at bore en adgang i den laterale maxillære sinusvæg. Sinus membran dissektion med omhyggelig frigivelse og elevation vil også blive udført. Præoperativ randomisering ved hjælp af computergenererede tilfældige tal vil blive brugt til at bestemme test- og kontrolbihuler for hver patient. Det knoglede bund i sinus maxillaris på teststedet vil blive forstærket med 4 til 5 g af en syntetisk knogleerstatning (BoneCeramic™ 1-2 mm) blandet med 10 til 15 ml CM. Kontrolstedet vil modtage en tilsvarende mængde knogleerstatning indlejret i 10 til 15 ml saltvandsopløsning. Patienterne vil blive frigivet fra hospitalet 2 timer efter operationen. De vil blive instrueret i postoperativ hygiejne og spiseadfærd. Alle patienter vil modtage postoperativ antibiotika og anti-inflammatorisk behandling.

2.5 - Implantatplacering og høst af knoglebiopsier

Efter 6 måneders heling vil implantatplacering følge rutinemæssige kirurgiske protokoller som anbefalet af implantatproducenten. Under lokalbedøvelse udføres et lineært midt-crestal-snit og fuldtykkelsesklap med frigørende snit, når det er nødvendigt. Derefter, med en 16:1 vinkelstykke fastgjort til en kirurgisk enhed og en trefinbor (Ø 3 mm), vil det transplanterede område, der svarer til 2. præmolar, 1. og 2. molar region, blive biopsieret på både højre og venstre side af maxilla (n=06 steder pr. patient), styret af en tidligere fremstillet kirurgisk stent af akrylharpiks. Knoglebiopsier vil derefter blive opdelt i to segmenter, hvor den ene vil blive opbevaret i 4% formaldehydopløsning til histologisk analyse og den anden i Eppendorf-hætteglas med RNALater til RT-PCR-analyse. Derefter følges sekvensen af ​​kirurgiske implantater som anbefalet af producenten for placering af 6 til 8 implantater pr. patient. Registrering af primær stabilitet ved indsættelse vil blive udført med både manuel momentnøgle og klassificeret i tre grupper. Et helende abutment vil derefter blive placeret, og sårlukning vil blive udført med ikke-resorberbart suturmateriale. En 6-måneders et-trins helingsprotokol vil blive vedtaget for alle implantater.

2.6 - CBCT billedanalyse

Højopløselige CBCT-billeder vil blive opnået på tre forskellige tidspunkter som en del af behandlingsprotokollen, hvilket betyder ved præoperativ knogletransplantation [baseline], 90 [T1] og 180 [T2] dage (implantationsplacering præoperativ), sigter på både præ-op kirurgisk planlægning og post-op evaluering af knogledannelsen. De morfometriske knogleparametre vil blive beregnet i 3D-analyse i henhold til anbefalingerne fra American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) som tidligere foreslået, og statistisk analyse vil blive brugt til at identificere de bedste parameterkombinationer, der sigter mod at differentiere trabekulær knogle til tre knogler kategorier: (i) sparsomt relateret til en løs knoglestruktur, (ii) mellemrelateret til en velstruktureret trabekulær knogle, og (iii) tætte knogletyper relateret til et massivt knogleområde med lidt mellemrum mellem trabeklerne.

2.7 - Histologiske og histomorfometriske analyser

Efter fjernelse af transplantatbiopsier ved implantatplacering vil knogleblokke, der indeholder kontrol- og testknoglestederne, blive formet og afkalket med 5 % HNO3. Blokkene vil dehydrere i en graderet alkoholserie, klare med xylen og blive indlejret i harpiks. Derefter vil harpiksen blive polymeriseret i et UV-lyskammer i 10 timer. Ved hjælp af en diamantmikrosav vil i alt tre 3 μm tykke skiver fra hver blok blive slebet på tværs af hver prøves langakse ved 50, 100 og 150 μm fra deres ydre del. Herefter vil rutinefarvning med hæmatoxylin-eosin (HE), Azur II og Pararosanilin blive udført med det formål at skelne mellem HP/β-TCP-partikler og nydannet knogle. Mikroskopisk analyse vil blive udført ved 24X forstørrelse ved hjælp af et optisk stereomikroskop forbundet til et digitalkamera. Billedanalyse vil blive udført ved hjælp af ImageJ®-softwaren.

2.8 - Realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Efter forberedelsen af ​​de indsamlede graftbiopsier til RNA-ekstraktion, vil real-time revers transcriptase-polymerase kædereaktion (RT-PCR) analyse blive anvendt til at kvantificere alkalisk phosphatase, vaskulær endotelvækstfaktor, Osteonectin, Osteopontin og type 1 kollagen.