Autogeeniset mesenkymaaliset kantasoluviljelmästä johdetut signalointimolekyylit luunmuodostuksen tehostajina luusiirreessä

1. Tavoitteet ja hypoteesi

   Aiemmin raportoituihin tutkimuksiin perustuen ja translaatiolähestymistapaa noudattaen hypoteesi, jonka mukaan viljeltyihin autogeenisiin kasvutekijöihin ja sytokiineihin liittyvä parakriininen vaikutus fysiologisissa pitoisuuksissa, jotka vaikuttavat paikallisesti siirretyissä kohdissa, saattaa edistää nopeampaa ja/tai tehokkaampaa soluvastetta ja siten indusoida merkittävämmän /nopeampaa luun muodostumista harkittiin. Näiden synteettisiin luunkorvikkeisiin lisättyjen molekyylien läsnäolo saattaa vaikuttaa positiivisesti paikalliseen solurekrytointiin (kemotaksis), proliferaatioon, erilaistumiseen ja luuproteiinisynteesiin. Myös toistuvia biologisia vaaroja, jotka liittyvät tavanomaisiin kudosmuokattuihin solusiirreyhdisteisiin, jotka yleensä liittyvät solujen ex vivo -manipulaatioon tuumorigeenisyyden, immunogeenisyyden ja aiemmin raportoitujen solujen erilaistumisilmiön osalta, lievennetään jättämällä soluelementin pois tästä prosessista. , koska joidenkin raporttien mukaan ne osoittavat arvaamatonta mitoottista käyttäytymistä, kun niitä on viljelty keinotekoisesti. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on laajentaa tätä translaatiotutkimusta päätutkijan prekliinisten tutkimusten jälkeen ehdottamalla prospektiivista satunnaistettua kontrolloitua kliinistä tutkimusta mahdollisista eduista, jotka liittyvät sellaisen kudosteknisen luusiirreyhdisteen käyttöön, joka sisältää tiivistettyä autogeenista soluviljelyalustaa (CM). ) ja hydroksyyliapatiitti/beeta-trikalsiumfosfaattipohjainen synteettinen luunkorvike (HP/β-TCP keraaminen). Erityisiä tavoitteita ovat vasta muodostuneen kalkkeutuneen kudoksen tiheyden analysointi tietokonetomografialla (CBCT), spesifisten immunohistokemiallisten luunmuodostusmerkkien (RT-PCR) ilmentäminen ja histomorfometrinen luun määrän arviointi. Split-mouth -tutkimusmallissa tuloksena oleva luun muodostuminen HP/β-TCP-siirteen jälkeen CM:n kanssa ja ilman sitä analysoidaan, verrataan ja kvantifioidaan eri ajankohtina.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1- Tutkimuksen suunnittelu

Prospektiivinen jaettu suu satunnaistettu kontrolloitu kliininen tutkimus valittiin tämän tutkimuksen tutkimussuunnitelmaksi. Sen jälkeen, kun tutkimuseettinen komitea on hyväksynyt protokollan ja rekisteröitynyt osoitteessa kliininen trials.gov CONSORTin ohjeiden mukaisesti 20 peräkkäistä potilasta, jotka hakevat leuan suun kuntoutusta Terveys- ja biotieteiden korkeakoulun PUCRS:n proteettisen hammaslääketieteen osastolta, kutsutaan osallistumaan tähän tutkimukseen.

2.2 - Lipoplastia ja ihmisen rasvakantasolujen (hASC) talteenotto/viljely.

HASC:ien keräämistä varten ehdotetaan vatsan lipoplastiaa, joka suoritetaan allekirjoitetun tietoisen suostumuksen jälkeen. Suonensisäisen sedaation ja täydentävän hapen vapautumisen alaisena oraalisella katetrilla sekä paikallispuudutuksessa suoritetaan tavallinen kirurginen lipoplastiatekniikka. Kuten aiemmin on kuvattu, tästä rasvaimumateriaalista 25-30 ml rasvaa siirretään 50 ml:n Falcon-putkeen. Sitten rasva pestään sentrifugoimalla (430Å~g 10 min), jolloin ylempi rasvakerros siirretään uuteen Falcon-putkeen, jossa seokseen lisätään yhtä suuri määrä kollagenaasiliuosta ja inkuboidaan 37°C:ssa vedessä. kylpy. Sentrifugoinnin jälkeen ylempi rasvakerros heitetään pois ja supernatantti poistetaan. Jäljelle jäänyt solupelletti, joka sisältää hASC:t, suspendoidaan uudelleen 15 ml:aan viljelyalustaa. Kun on lisätty 15 ml lämmintä elatusainetta, solususpensio siirretään T175-viljelypulloon. hASC:ita inkuboidaan kosteassa ympäristössä 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Sitten solupelletti suspendoidaan uudelleen lämpimään elatusaineeseen ja kylvetään uusiin soluviljelypulloihin.

2.3 - Väkevän viljelyalustan (CM) valmistus ja analyysi

Kantasoluviljely ja CM-valmistus suoritetaan GMP-sertifioidussa regeneratiivisten lääkevalmisteiden laitoksessa. Aluksi eristettyjen hASC:iden pinta-antigeeniprofiilit kolmannessa siirrossa karakterisoidaan virtaussytometrialla. CD73-, CD90-, CD105- ja CD44-markkerien läsnäolo sekä CD34-, CD45-, CD11b-, CD19- ja HLA-DR-merkkien puuttuminen arvioidaan halutun solufenotyypin vahvistamiseksi International Society of Cellular Therapy -yhdistyksen ohjeiden mukaisesti. Sitten näiden solujen näyte karakterisoidaan myös värjäyksellä (Alizarin Red S) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solulaajentuminen ja CM luodaan vakiokantasoluviljelyprotokollien mukaisesti. Ennen kliinistä käyttöä CM tutkitaan paitsi bakteerien, sienten tai mykoplasmojen saastumisen varalta, myös virustartunnan varalta, mukaan lukien B- ja C-hepatiitti, ihmisen immuunikato- ja ihmisen T-soluleukemiavirukset. Sitten CM varastoidaan kunnolla viileässä ja lähetetään kliiniseen käyttöön (jopa 6 tuntia), jotta vältetään olemassa olevien signaalimolekyylien pitkäaikainen denaturaatio/inaktivoituminen, kuten aiemmin ehdotettiin.

2.4 - Poskiontelon lattian kohotusmenettely

IV-sedaatiossa ja täydentävässä hapen vapauttamisessa oraalisella katetrilla sekä paikallispuudutuksessa yläleuan luu siirretään sisäisesti poraamalla sisäänpääsy poskiontelon lateraaliseen seinämään. Suoritetaan myös sinuskalvon dissektio varovaisesti vapauttamalla ja kohottamalla. Ennen leikkausta tapahtuvaa satunnaistamista tietokoneella luotujen satunnaislukujen avulla käytetään kunkin potilaan testi- ja kontrollionteloiden määrittämiseen. Testialueen poskiontelon luista pohjaa täydennetään 4–5 g:lla synteettistä luunkorviketta (BoneCeramic™ 1–2 mm) sekoitettuna 10–15 ml:aan CM:a. Kontrollikohta saa samanlaisen määrän luunkorviketta upotettuna 10-15 ml:aan suolaliuosta. Potilaat vapautetaan sairaalasta 2 tuntia leikkauksen jälkeen. Heille opastetaan leikkauksen jälkeistä hygieniaa ja syömiskäyttäytymistä. Kaikki potilaat saavat postoperatiivista antibiootti- ja tulehduskipuhoitoa.

2.5 - Implanttien asettaminen ja luubiopsioiden otto

Kuuden kuukauden paranemisen jälkeen implantti asetetaan rutiininomaisten kirurgisten protokollien mukaisesti implantin valmistajan suosittelemalla tavalla. Paikallispuudutuksessa tehdään harjan keskiosan lineaarinen viilto ja koko paksuus läppä vapauttavilla viilloilla aina tarvittaessa. Sitten leikkausyksikköön kiinnitetyllä 16:1 vastakulmalla ja trefiiniporanterällä (Ø 3 mm) 2. premolar-aluetta, 1. ja 2. poskialuetta vastaava siirretty alue otetaan biopsia sekä yläleuan oikealta että vasemmalta puolelta. (n = 06 kohtaa potilasta kohti), ohjataan aiemmin tehdyllä akryylihartsista tehdyllä kirurgisella stentillä. Luubiopsiat jaetaan sitten kahteen osaan, joista toinen säilytetään 4-prosenttisessa formaldehydiliuoksessa histologista analyysiä varten ja toinen Eppendorf-pulloissa, joissa on RNALater RT-PCR-analyysiä varten. Tämän jälkeen noudatetaan valmistajan suosittelemaa implanttikirurgisten poranterojen järjestystä 6–8 implantin sijoittamiseksi potilasta kohti. Ensisijaisen vakauden rekisteröinti paikalleen asennettaessa tehdään sekä manuaalisella momenttiavaimella että se luokitellaan kolmeen ryhmään. Sitten asetetaan parantava tuki ja haava suljetaan ei-resorboituvalla ommelmateriaalilla. Kaikille implanteille otetaan käyttöön 6 kuukauden yksivaiheinen paranemisprotokolla.

2.6 - CBCT-kuvaanalyysi

Korkearesoluutioisia CBCT-kuvia otetaan kolmessa eri ajankohdassa osana hoitoprotokollaa, eli ennen leikkausta luusiirrännäisenä [perustilanne], 90 [T1] ja 180 [T2] päivää (implanttien asennus ennen leikkausta), Tavoitteena on sekä leikkausta edeltävä suunnittelu että luunmuodostuksen jälkeinen arviointi. Morfometriset luuparametrit lasketaan 3D-analyysissä American Society for Bone and Mineral Researchin (ASBMR) suositusten mukaisesti, kuten aiemmin ehdotettiin, ja tilastollista analyysiä käytetään tunnistamaan parhaat parametriyhdistelmät, joilla pyritään erottamaan trabekulaariluu kolmeen luuhun. luokat: (i) harvat liittyvät löysään luurakenteeseen, (ii) keskitaso liittyvät hyvin rakenteelliseen trabekulaariseen luuhun ja (iii) tiheät luutyypit, jotka liittyvät massiiviseen luualueeseen, jossa trabekulien välissä on vähän tilaa.

2.7 - Histologiset ja histomorfometriset analyysit

Kun siirrännäiset biopsiat on poistettu implantin asettamisen yhteydessä, kontrolli- ja testiluun kohdat sisältävät luulohkot muotoillaan ja niistä poistetaan kalkki 5 % HNO3:lla. Lohkot kuivuvat asteittain alkoholisarjassa, kirkastuvat ksyleenillä ja upotetaan hartsiin. Sitten hartsia polymeroidaan UV-valokammiossa 10 tunnin ajan. Timanttimikrosahan avulla yhteensä kolme 3 μm:n paksuista viipaletta kustakin lohkosta hiotaan poikittain kunkin näytteen pitkittäisakseliin nähden 50, 100 ja 150 μm:n etäisyydellä niiden ulkoisesta osasta. Tämän jälkeen suoritetaan rutiinivärjäys hematoksyliini-eosiinilla (HE), Azur II:lla ja parrosaniliinilla, jotta HP/β-TCP-partikkelit ja vasta muodostunut luu voidaan erottaa toisistaan. Mikroskooppinen analyysi suoritetaan 24-kertaisella suurennuksella käyttämällä digitaalikameraan kytkettyä optista stereomikroskooppia. Kuva-analyysi suoritetaan ImageJ®-ohjelmistolla.

2.8 - Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

Sen jälkeen kun kerätyt siirrännäiset biopsiat on valmistettu RNA:n uuttamista varten, käytetään reaaliaikaista käänteiskopioijapolymeraasiketjureaktioanalyysiä (RT-PCR) alkalisen fosfataasin, verisuonten endoteelin kasvutekijän, osteonektiinin, osteopontiinin ja tyypin 1 kollageenin kvantifioimiseksi.