Сигнальные молекулы, полученные из культуры аутогенных мезенхимальных стволовых клеток, как усилители формирования кости при костной пластике

1. Цели и гипотеза

   Основанная на ранее опубликованных исследованиях и следуя трансляционному подходу, гипотеза о том, что паракринный эффект, связанный с культивируемыми аутогенными факторами роста и цитокинами в физиологических концентрациях, действующих локально в местах трансплантации, может способствовать более быстрому и/или более эффективному клеточному ответу и, следовательно, вызывать более значительный /учитывалось более быстрое формирование кости. Присутствие этих молекул, добавленных к синтетическим заменителям кости, может положительно влиять на локальное рекрутирование клеток (хемотаксис), пролиферацию, дифференцировку и синтез костного белка. Кроме того, повторяющиеся биологические опасности, присущие обычным соединениям тканеинженерных клеточных трансплантатов, обычно связанные с манипулированием клетками ex vivo с точки зрения туморогенности, иммуногенности и ранее описанного явления клеточной дедифференцировки, могут быть смягчены путем исключения клеточного элемента из этого процесса. , поскольку в некоторых отчетах считается, что они демонстрируют непредсказуемое митотическое поведение после искусственного культивирования. Настоящее исследование направлено на дальнейшее расширение этого поступательного исследования после доклинических исследований, проведенных главным исследователем, предлагая проспективное рандомизированное контролируемое клиническое исследование возможных преимуществ, связанных с применением тканеинженерного костного трансплантата, содержащего концентрированную аутогенную среду для культивирования клеток (CM). ) и синтетический заменитель кости на основе гидроксилапатита/бета-трикальцийфосфата (керамика HP/β-TCP). Конкретные цели включают анализ плотности новообразованной кальцифицированной ткани с помощью компьютерной томографии (КЛКТ), экспрессию специфических иммуногистохимических маркеров формирования кости (ОТ-ПЦР) и гистоморфометрическую оценку количества кости. В модели исследования с разделением рта результирующее формирование кости после трансплантации HP/β-TCP с CM и без него будет проанализировано, сравнено и количественно оценено в разные моменты времени.

2. Материалы и методы

2.1- Дизайн исследования

В качестве дизайна для настоящего исследования было выбрано проспективное рандомизированное контролируемое клиническое исследование с разделением рта. После утверждения протокола Комитетом по этике исследований и регистрации на сайте Clinical Trials.gov. Платформа, следуя рекомендациям CONSORT, 20 последовательных пациентов, которые обращаются за реабилитацией верхней челюсти в отделение ортопедической стоматологии Школы здравоохранения и наук о жизни - PUCRS, Бразилия, будут приглашены для участия в настоящем исследовании.

2.2 - Липопластика и сбор/культивирование стволовых клеток жировой ткани человека (hASC).

Для сбора hASC будет предложена процедура абдоминальной липопластики, которая будет выполнена после подписания информированного согласия. Под внутривенной седацией и дополнительным выделением кислорода с помощью орального катетера наряду с местной анестезией будет выполнена стандартная хирургическая техника липопластики. Как описано ранее, из этого материала для липосакции от 25 до 30 мл жира будет перенесено в пробирку Falcon объемом 50 мл. Затем жир промывают центрифугированием (430 Å~g 10 мин), верхний слой жира переносят в новую пробирку Falcon, где к смеси добавляют равный объем раствора коллагеназы и инкубируют при 37°C в воде. ванна. После центрифугирования верхний слой жира отбрасывают, а надосадочную жидкость удаляют. Оставшийся клеточный осадок, содержащий hASC, ресуспендируют с 15 мл культуральной среды. После добавления 15 мл теплой культуральной среды клеточную суспензию переносят в культуральную колбу Т175. hASC инкубируют во влажной среде при 37°C и 5% CO2. Затем клеточный осадок ресуспендируют в теплой культуральной среде и высевают в новые флаконы для культивирования клеток.

2.3 - Приготовление и анализ концентрированной питательной среды (СМ)

Культивирование стволовых клеток и подготовка КМ будут проводиться в сертифицированном GMP центре для продуктов регенеративной медицины. Сначала профили поверхностных антигенов изолированных hASCs при третьем пассаже будут охарактеризованы с помощью проточной цитометрии. Наличие маркеров CD73, CD90, CD105 и CD44 и отсутствие CD34, CD45, CD11b, CD19 и HLA-DR будет оцениваться для подтверждения желаемого клеточного фенотипа в соответствии с рекомендациями протоколов Международного общества клеточной терапии. Затем образец этих клеток также будет охарактеризован путем окрашивания (ализариновый красный S) в соответствии с инструкциями производителя. Расширение клеток и СМ будут генерироваться в соответствии со стандартными протоколами культивирования стволовых клеток. Перед клиническим использованием КМ исследуют не только на предмет загрязнения бактериями, грибками или микоплазмами, но и на предмет заражения вирусами, включая вирусы гепатита В и С, вирусы иммунодефицита человека и Т-клеточного лейкоза человека. Затем СМ будет должным образом храниться в холодильнике и отправлен для клинического применения (до 6 часов), чтобы избежать долгосрочной денатурации/инактивации присутствующих сигнальных молекул, как предполагалось ранее.

2.4 - Процедура поднятия дна верхнечелюстной пазухи

При внутривенной седации и дополнительном выделении кислорода с помощью орального катетера, наряду с местной анестезией, верхнечелюстная кость будет трансплантирована изнутри путем сверления доступа в латеральной стенке верхнечелюстной пазухи. Также будет выполнена диссекция мембраны пазухи с осторожным освобождением и возвышением. Предоперационная рандомизация с помощью компьютерных случайных чисел будет использоваться для определения тестовых и контрольных пазух для каждого пациента. Костное дно верхнечелюстной пазухи на испытательном участке будет аугментировано 4–5 г синтетического заменителя кости (BoneCeramic™ 1–2 мм), смешанного с 10–15 мл СМ. Контрольный участок получит такое же количество заменителя кости, погруженное в 10–15 мл физиологического раствора. Пациенты будут выписаны из стационара через 2 часа после операции. Они будут проинструктированы о послеоперационной гигиене и пищевом поведении. Все пациенты будут получать послеоперационную антибиотикотерапию и противовоспалительную терапию.

2.5 - Установка имплантата и забор биопсии кости

После 6 месяцев заживления установка имплантата будет осуществляться в соответствии с обычными хирургическими протоколами, рекомендованными производителем имплантата. Под местной анестезией будет выполнен линейный разрез посередине альвеолярного гребня и полнослойный лоскут с послабляющими разрезами, когда это необходимо. Затем с помощью углового наконечника 16:1, прикрепленного к хирургическому блоку, и трепана (Ø 3 мм) будет проведена биопсия области трансплантата, соответствующей областям 2-го премоляра, 1-го и 2-го моляров, как с правой, так и с левой стороны верхней челюсти. (n = 06 мест на пациента) с использованием ранее изготовленного хирургического стента из акриловой пластмассы. Затем биоптаты костей будут разделены на два сегмента, один из которых будет храниться в 4% растворе формальдегида для гистологического анализа, а другой — во флаконах Eppendorf с RNALater для анализа RT-PCR. Затем будет соблюдаться последовательность имплантации хирургических боров, рекомендованная производителем, для установки от 6 до 8 имплантатов на пациента. Регистрация первичной стабильности при введении будет производиться как ручным динамометрическим ключом, так и классифицирована по трем группам. Затем будет установлен формирователь десны, а рана будет закрыта нерассасывающимся шовным материалом. Для всех имплантатов будет принят протокол одноэтапного заживления в течение 6 месяцев.

2.6 - Анализ изображений КЛКТ

Изображения КЛКТ с высоким разрешением будут получены в трех разных временных точках в рамках протокола лечения, то есть в предоперационном периоде с костным трансплантатом [исходный уровень], через 90 [T1] и 180 [T2] дней (установка имплантата до операции), с целью как предоперационного хирургического планирования, так и послеоперационной оценки формирования кости. Морфометрические параметры кости будут рассчитываться в 3D-анализе в соответствии с рекомендациями Американского общества исследований костей и минералов (ASBMR), как было предложено ранее, а статистический анализ будет использоваться для определения наилучших комбинаций параметров с целью дифференциации трабекулярной кости на три кости. категории: (i) редкие, связанные с рыхлой структурой кости, (ii) промежуточные, связанные с хорошо структурированной трабекулярной костью, и (iii) плотные типы костей, связанные с массивной костной областью с небольшим пространством между трабекулами.

2.7 - Гистологический и гистоморфометрический анализы

После удаления биоптатов трансплантата при установке имплантата костным блокам, содержащим контрольные и тестовые участки кости, придают форму и декальцинируют с помощью 5% HNO3. Блоки будут обезвожены в последовательном спирте, осветлены ксилолом и помещены в смолу. Затем смола полимеризуется в камере УФ-излучения в течение 10 часов. С помощью алмазной микропилы три среза толщиной 3 мкм из каждого блока будут отшлифованы поперек длинной оси каждого образца на расстоянии 50, 100 и 150 мкм от их внешней части. После этого будет проведено обычное окрашивание гематоксилин-эозином (HE), Azur II и Pararosaniline с целью различения частиц HP/β-TCP и новообразованной кости. Микроскопический анализ будет проводиться при 24-кратном увеличении с использованием оптического стереомикроскопа, подключенного к цифровой камере. Анализ изображения будет выполняться с использованием программного обеспечения ImageJ®.

2.8 - Полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR)

После подготовки собранных биоптатов трансплантата к экстракции РНК будет применен анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени для количественного определения щелочной фосфатазы, фактора роста эндотелия сосудов, остеонектина, остеопонтина и коллагена 1 типа.