Autogena mesenkymala stamcellskultur-härledda signalmolekyler som förstärkare av benbildning vid bentransplantation

1. Mål och hypotes

   Baserat i tidigare rapporterade studier och efter ett translationellt tillvägagångssätt, kan en hypotes att den parakrina effekten kopplad till odlade autogena tillväxtfaktorer och cytokiner vid fysiologiska koncentrationer som verkar lokalt på transplanterade ställen främja ett snabbare och/eller mer effektivt cellsvar och följaktligen inducera ett mer signifikant /snabbare benbildning övervägdes. Närvaron av dessa molekyler som läggs till syntetiska bensubstitut kan verka positivt i termer av lokal cellrekrytering (kemotaxi), proliferation, differentiering och benproteinsyntes. Återkommande biologiska risker involverade i konventionella vävnadskonstruerade cellulära transplantatföreningar, vanligtvis kopplade till ex vivo-manipulation av celler i termer av tumörframkallande egenskaper, immunogenicitet och det tidigare rapporterade celldedifferentieringsfenomenet skulle mildras genom att cellelementet utesluts i denna process. , eftersom de av vissa rapporter anses presentera oförutsägbart mitotiskt beteende när de väl har odlats på konstgjord väg. Den föreliggande studien syftar till att ytterligare utöka denna translationella undersökning efter prekliniska studier av huvudutredaren, och föreslår en prospektiv randomiserad kontrollerad klinisk prövning av de möjliga fördelarna som är förknippade med appliceringen av en vävnadskonstruerad bentransplantatförening som innehåller koncentrerat autogent cellodlat medium (CM) ) och en hydroxylapatit/beta-trikalciumfosfatbaserad syntetisk benersättning (HP/β-TCP-keramik). Specifika mål inkluderar analyser av densiteten av den nybildade förkalkade vävnaden genom datortomografi (CBCT), uttryck av specifika immunhistokemiska benbildningsmarkörer (RT-PCR) och histomorfometrisk benmängdsutvärdering. I en studiemodell med delad mun kommer den resulterande benbildningen efter HP/β-TCP-transplantation med och utan CM att analyseras, jämföras och kvantifieras vid olika tidpunkter.

2. Material och metoder

2.1- Studiedesign

En prospektiv delad mun, randomiserad kontrollerad klinisk prövning valdes som studiedesign för denna undersökning. Efter protokollgodkännande av forskningsetiska kommittén och registrering på clinical trials.gov plattform, enligt CONSORT-riktlinjer, kommer 20 på varandra följande patienter som söker överkäksrehabilitering vid avdelningen för protesodontologi vid School of Health and Life Sciences - PUCRS, Brasilien, att bjudas in att delta i denna undersökning.

2.2 - Skörd/odling av lipoplastik och humana fettstamceller (hASC).

För hASC-skörd kommer en buklipoplastikprocedur att föreslås och utföras efter ett undertecknat informerat samtycke. Under intravenös sedering och kompletterande syrefrisättning med en oral kateter, tillsammans med lokalbedövning, kommer en vanlig kirurgisk lipoplastikteknik att utföras. Som tidigare beskrivits, från detta fettsugningsmaterial kommer 25 till 30 ml fett att överföras till ett 50 ml Falcon-rör. Fettet kommer sedan att tvättas genom centrifugering (430Å~g 10 min), vilket är det övre fettskiktet som överförs till ett nytt Falcon-rör, där en lika stor volym kollagenaslösning tillsätts till blandningen och inkuberas vid 37°C i vatten. bad. Efter centrifugering kommer det övre fettlagret att kasseras och supernatanten avlägsnas. Den återstående cellpelleten som innehåller hASC:erna kommer att återsuspenderas med 15 ml odlingsmedium. Efter tillsats av 15 ml varmt odlingsmedium kommer cellsuspensionen att överföras till en T175-odlingskolv. HASC:erna kommer att inkuberas i en fuktad miljö vid 37°C och 5% CO2. Sedan kommer cellpelleten att återsuspenderas i varmt odlingsmedium och sås i nya cellodlingskolvar.

2.3 - Beredning och analys av koncentrerat odlingsmedium (CM).

Stamcellsodling och CM-beredning kommer att utföras på en GMP-certifierad anläggning för regenerativa läkemedelsprodukter. Till en början kommer ytantigenprofilerna för isolerade hASCs vid tredje passage att karakteriseras av flödescytometri. Förekomsten av CD73-, CD90-, CD105- och CD44-markörer och frånvaron av CD34, CD45, CD11b, CD19 och HLA-DR kommer att bedömas för att bekräfta den önskade cellfenotypen som rekommenderas av protokoll från International Society of Cellular Therapy.[ Sedan kommer ett prov av dessa celler också att kännetecknas av färgning (Alizarin Red S) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Cellexpansion och CM kommer att genereras enligt vanliga stamcellsodlingsprotokoll. Före klinisk användning kommer CM att undersökas inte bara för kontaminering med bakterier, svampar eller mykoplasma utan också för infektion med virus inklusive hepatit B och C, human immunbrist och humana T-cellsleukemivirus. Sedan kommer CM att kylas ordentligt och skickas till klinisk tillämpning (upp till 6 timmar), för att undvika långvarig denaturering/inaktivering av nuvarande signalmolekyler, som tidigare föreslagits.

2.4 - Procedur för höjning av sinus maxillär golv

Under IV-sedation och kompletterande syrefrisättning med en oral kateter, tillsammans med lokalbedövning, kommer maxillärbenet att transplanteras internt genom att borra en åtkomst i den laterala maxillära sinusväggen. Sinusmembrandissektion med försiktig frisättning och höjning kommer också att utföras. Preoperativ randomisering med datorgenererade slumpmässiga siffror kommer att användas för att bestämma test- och kontrollbihålor för varje patient. Det beniga golvet i sinus maxillaris på teststället kommer att förstärkas med 4 till 5 g av en syntetisk benersättning (BoneCeramic™ 1-2 mm) blandad med 10 till 15 ml CM. Kontrollstället kommer att få liknande mängd benersättning inbäddad i 10 till 15 ml saltlösning. Patienterna kommer att släppas från sjukhuset 2 timmar efter operationen. De kommer att instrueras i postoperativ hygien och ätbeteende. Alla patienter kommer att få postoperativa antibiotika och antiinflammatoriska terapier.

2.5 - Implantatplacering och skörd av benbiopsier

Efter 6 månaders läkning kommer implantatplaceringen att följa rutinmässiga kirurgiska protokoll som rekommenderas av implantattillverkaren. Under lokalbedövning kommer ett linjärt snitt i mitten av crestal och en flik i full tjocklek att utföras med släppande snitt närhelst det är nödvändigt. Sedan, med en vinkelvinkel på 16:1 kopplad till en kirurgisk enhet och en trefinborr (Ø 3 mm), kommer det ympade området som motsvarar 2:a premolar, 1:a och 2:a molarregionen att biopsieras på både höger och vänster sida av maxillan (n=06 platser per patient), styrd av en tidigare gjord kirurgisk stent av akrylharts. Benbiopsier kommer sedan att delas upp i två segment, där en kommer att lagras i 4% formaldehydlösning för histologisk analys och den andra i Eppendorf-flaskor med RNALater för RT-PCR-analys. Därefter kommer sekvensen av implantatkirurgiska borr som rekommenderas av tillverkaren att följas för placering av 6 till 8 implantat per patient. Registrering av primär stabilitet vid införing kommer att göras med både manuell momentnyckel och klassificeras i tre grupper. En läkningsdistans kommer sedan att placeras och sårförslutning kommer att utföras med icke-resorberbart suturmaterial. Ett 6-månaders enstegsläkningsprotokoll kommer att antas för alla implantat.

2.6 - CBCT-bildanalys

Högupplösta CBCT-bilder kommer att erhållas vid tre olika tidpunkter som en del av behandlingsprotokollet, vilket innebär vid preoperativt bentransplantat [baseline], 90 [T1] och 180 [T2] dagar (implantatplacering preoperativt), som syftar till både pre-op kirurgisk planering och post-op utvärdering av benbildningen. De morfometriska benparametrarna kommer att beräknas i 3D-analys enligt rekommendationerna från American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) som tidigare föreslagits, och statistisk analys kommer att användas för att identifiera de bästa parameterkombinationerna som syftar till att differentiera trabekulärt ben till tre ben kategorier: (i) glesrelaterad till en lös benstruktur, (ii) intermediärrelaterad till ett välstrukturerat trabekulärt ben, och (iii) täta bentyper relaterade till ett massivt benområde med litet utrymme mellan trabeculae.

2.7 - Histologiska och histomorfometriska analyser

Efter avlägsnande av transplantatbiopsier vid implantatplacering kommer benblock som innehåller kontroll- och testbensställena att formas och avkalkas med 5 % HNO3. Blocken kommer att torka ut i en graderad alkoholserie, klarna med xylen och bäddas in i harts. Därefter kommer hartset att polymeriseras i en UV-ljuskammare i 10 timmar. Med hjälp av en diamantmikrosåg kommer totalt tre 3 μm tjocka skivor från varje block att slipas tvärs varje preparats långaxel på 50, 100 och 150 μm från deras yttre del. Efter detta kommer rutinfärgning med hematoxylin-eosin (HE), Azur II och Pararosanilin att göras i syfte att skilja mellan HP/β-TCP-partiklar och nybildat ben. Mikroskopisk analys kommer att utföras med 24X förstoring med hjälp av ett optiskt stereomikroskop kopplat till en digitalkamera. Bildanalys kommer att utföras med hjälp av programvaran ImageJ®.

2.8 - Realtidspolymeraskedjereaktion (RT-PCR)

Efter beredningen av de insamlade transplantatbiopsierna för RNA-extraktion, kommer realtidsanalys av omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) att tillämpas för att kvantifiera alkaliskt fosfatas, vaskulär endotelial tillväxtfaktor, Osteonectin, Osteopontin och typ 1 kollagen.