Autogén mezenchimális őssejttenyészetből származó jelzőmolekulák, mint a csontképződés fokozói a csontátültetésben

1. Célok és hipotézisek

   Korábban közölt tanulmányok alapján és transzlációs megközelítést követve egy olyan hipotézis, amely szerint a tenyésztett autogén növekedési faktorokhoz és citokinekhez kötődő parakrin hatás fiziológiás koncentrációban, lokálisan hatnak az átültetett helyeken, elősegítheti a gyorsabb és/vagy hatékonyabb sejtválaszt, következésképpen jelentősebb sejtválaszt indukálhat. /gyorsabb csontképződést vettek figyelembe. Ezeknek a szintetikus csontpótló anyagokhoz adott molekuláknak a jelenléte pozitívan hathat a lokális sejtrekrutáció (kemotaxis), a proliferáció, a differenciálódás és a csontfehérje szintézis szempontjából. Ezenkívül a hagyományos szövettanilag módosított sejttranszplantációs vegyületekkel kapcsolatos visszatérő biológiai veszélyeket, amelyek általában a sejtek ex vivo manipulálásával kapcsolódnak a tumorgenicitás, az immunogenitás és a korábban közölt sejt dedifferenciálódási jelenség tekintetében, mérsékelhető lenne a sejtelem kizárása ebből a folyamatból. , mivel egyes jelentések szerint mesterséges tenyésztést követően kiszámíthatatlan mitotikus viselkedést mutatnak. Jelen tanulmány célja, hogy tovább bővítse ezt a transzlációs vizsgálatot a vezető kutató által végzett preklinikai tanulmányokat követően, prospektív, randomizált, kontrollált klinikai vizsgálatot javasolva a koncentrált autogén sejttenyésztő táptalajt (CM) tartalmazó, szövettanilag módosított csontgraft vegyület alkalmazásának lehetséges előnyeiről. ) és egy hidroxi-apatit/béta-trikalcium-foszfát alapú szintetikus csontpótló (HP/β-TCP kerámia). A specifikus célok közé tartozik az újonnan képződött meszesedett szövet denzitásának elemzése számítógépes tomográfiával (CBCT), specifikus immunhisztokémiai csontképződési markerek (RT-PCR) expressziója és hisztomorfometrikus csontmennyiség értékelése. Egy osztott szájú vizsgálati modellben a HP/β-TCP beültetés után eredő csontképződést CM-mel és anélkül elemzik, összehasonlítják és számszerűsítik különböző időpontokban.

2. Anyagok és metódusok

2.1- Tanulmánytervezés

A jelen vizsgálathoz egy prospektív, hasított szájú randomizált, kontrollált klinikai vizsgálatot választottak vizsgálati tervként. Miután a kutatási etikai bizottság jóváhagyta a protokollt, és regisztrálták a klinikai trials.gov oldalon platformon, a CONSORT irányelveit követve, 20 egymást követő, a brazíliai PUCRS Egészségügyi és Élettudományi Iskola Protetikai Fogászati ​​Osztályán maxilláris szájrehabilitációt kérő pácienst hívnak meg a jelen vizsgálatban való részvételre.

2.2 - Lipoplasztika és emberi zsíros őssejtek (hASC) begyűjtése/tenyésztése.

A hASC-k begyűjtése esetén a hasi lipoplasztikát javasolják, és aláírt, tájékozott beleegyezést követően hajtják végre. Intravénás szedáció és orális katéterrel kiegészített oxigénfelszabadítás mellett helyi érzéstelenítés mellett standard sebészeti lipoplasztikai technika kerül végrehajtásra. A korábban leírtak szerint ebből a zsírleszívó anyagból 25-30 ml zsír kerül át egy 50 ml-es Falcon csőbe. A zsírt ezután centrifugálással (430 Å~g 10 perc) mossuk, a felső zsírréteget átvisszük egy új Falcon csőbe, ahol azonos térfogatú kollagenáz oldatot adunk a keverékhez, és 37 °C-on vízben inkubáljuk. fürdőkád. Centrifugálás után a felső zsírréteget eldobjuk, és a felülúszót eltávolítjuk. A hASC-ket tartalmazó maradék sejtpelletet 15 ml táptalajban újraszuszpendáljuk. 15 ml meleg táptalaj hozzáadása után a sejtszuszpenziót egy T175 tenyésztő lombikba visszük át. A hASC-ket párás környezetben, 37 °C-on és 5% CO2-tartalom mellett inkubálják. Ezután a sejtpelletet meleg tenyésztőközegben újraszuszpendáljuk, és új sejttenyésztő lombikokba oltjuk.

2.3 - Koncentrált tápközeg (CM) előkészítése és elemzése

Az őssejttenyésztést és a CM-előkészítést egy GMP-tanúsítvánnyal rendelkező regeneratív gyógyszerkészítmények létesítményében végzik. Először az izolált hASC-k felületi antigénprofiljait a harmadik passzázsnál áramlási citometriával jellemezzük. A CD73, CD90, CD105 és CD44 markerek jelenlétét, valamint a CD34, CD45, CD11b, CD19 és HLA-DR hiányát értékeljük a kívánt sejtfenotípus megerősítésére, amint azt a Nemzetközi Sejtterápiás Társaság protokolljai javasolják. Ezután ezeknek a sejteknek a mintáját festéssel (Alizarin Red S) is jellemezzük a gyártó utasításainak megfelelően. A sejtszaporulat és a CM a szabványos őssejttenyésztési protokollok szerint jön létre. A klinikai felhasználás előtt a CM-et nem csak baktériumokkal, gombákkal vagy mikoplazmákkal való szennyeződés szempontjából vizsgálják, hanem vírusokkal, köztük hepatitis B-vel és C-vel, humán immunhiányos és humán T-sejtes leukémia vírusokkal való fertőzést is. Ezután a CM-et megfelelően hűtve tárolják és klinikai alkalmazásra küldik (legfeljebb 6 órán keresztül), hogy elkerüljék a jelenlévő jelzőmolekulák hosszú távú denaturálódását/inaktiválását, ahogy azt korábban javasoltuk.

2.4 - A maxilláris sinus padlójának emelési eljárása

IV szedáció és orális katéterrel végzett kiegészítő oxigénfelszabadítás mellett helyi érzéstelenítés mellett a maxilláris csontot belsőleg ültetik be, az oldalsó arcüreg falába fúrva. Szintén elvégzik a szinusz membrán disszekcióját óvatos elengedéssel és emeléssel. A számítógéppel generált véletlenszámok alapján történő műtét előtti véletlenszerűsítést használjuk a vizsgálati és kontroll sinusok meghatározására minden egyes betegnél. Az arcüreg csontos fenekét a vizsgálati helyen 4-5 g szintetikus csontpótlóval (BoneCeramic™ 1-2 mm) 10-15 ml CM-mel keverjük ki. A kontroll hely hasonló mennyiségű csontpótlót kap 10-15 ml sóoldatba ágyazva. A betegeket a műtét után 2 órával kiengedik a kórházból. Oktatást kapnak a műtét utáni higiéniáról és az étkezési viselkedésről. Minden beteg posztoperatív antibiotikumot és gyulladáscsökkentő kezelést kap.

2.5 - Implantátumbeültetés és csontbiopszia begyűjtése

6 hónapos gyógyulás után az implantátum behelyezése az implantátum gyártója által javasolt rutin műtéti protokollok szerint történik. Helyi érzéstelenítésben a krestális közepén lineáris bemetszést és teljes vastagságú lebenyet hajtanak végre, szükség esetén elengedő bemetszésekkel. Ezt követően egy sebészeti egységhez csatlakoztatott 16:1 kontraszöggel és egy trephine fúróval (Ø 3 mm) a 2. premolaris, 1. és 2. moláris régiónak megfelelő oltott területet biopsziával veszik a maxilla jobb és bal oldalán egyaránt. (n=06 hely betegenként), egy korábban elkészített akrilgyanta sebészeti stent vezetésével. A csontbiopsziákat ezután két részre osztják, ahol az egyiket 4%-os formaldehid oldatban tárolják szövettani elemzéshez, a másikat pedig RNALaterrel ellátott Eppendorf-fiolákban RT-PCR elemzéshez. Ezután a gyártó által javasolt implantátum-sebészeti fúrók sorrendjét követik betegenként 6-8 implantátum behelyezésénél. Az elsődleges stabilitás regisztrálása a behelyezéskor kézi nyomatékkulccsal történik, és három csoportba sorolható. Ezután egy gyógyító műcsonkot helyeznek el, és a sebzárást nem felszívódó varróanyaggal végzik. Minden implantátum esetében 6 hónapos, egylépcsős gyógyulási protokollt alkalmaznak.

2.6 - CBCT képelemzés

A kezelési protokoll részeként három különböző időpontban nagy felbontású CBCT-képeket készítenek, azaz a műtét előtti csontgraftnál [alapvonal], 90 [T1] és 180 [T2] napon (az implantátum beültetése előtt), a műtét előtti tervezést és a csontképződés műtét utáni értékelését egyaránt célozzák. A morfometrikus csontparamétereket 3D analízissel számítják ki az Amerikai Csont- és Ásványkutatási Társaság (ASBMR) ajánlásai szerint, amint azt korábban javasolták, és statisztikai elemzéssel azonosítják a legjobb paraméter-kombinációkat, amelyek célja a trabekuláris csont három csonttá történő megkülönböztetése. kategóriák: (i) a laza csontszerkezethez kapcsolódó ritka, (ii) a jó szerkezetű trabekuláris csonthoz kapcsolódó közepes, és (iii) a sűrű csonttípusok, amelyek egy masszív csontterülethez kapcsolódnak, kis távolsággal a trabekulák között.

2.7 - Szövettani és hisztomorfometriai elemzések

A graftbiopsziák implantátum beültetéskor történő eltávolítását követően a kontroll- és a tesztcsont helyeket tartalmazó csontblokkokat formázzák és 5%-os HNO3-mal vízkőtelenítik. A tömbök fokozatos alkoholos sorozatban dehidratálódnak, xilollal derülnek ki és gyantába ágyazódnak. Ezután a gyantát UV-fénykamrában polimerizálják 10 órán keresztül. Gyémánt mikrofűrésszel minden blokkból összesen három 3 μm vastag szeletet csiszolnak le keresztirányban az egyes minták hossztengelyére, a külső részüktől 50, 100 és 150 μm távolságra. Ezt követően rutin festést végeznek hematoxilin-eozinnal (HE), Azur II-vel és Pararosanilinnel, hogy különbséget tegyenek a HP/β-TCP részecskék és az újonnan képződött csont között. A mikroszkópos elemzést 24-szeres nagyítás mellett, digitális kamerához csatlakoztatott optikai sztereó mikroszkóppal végezzük. A képelemzés az ImageJ® szoftverrel történik.

2.8 – Valós idejű polimeráz láncreakció (RT-PCR)

Az összegyűjtött graftbiopsziák RNS-kivonásra való előkészítését követően valós idejű reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció (RT-PCR) elemzést alkalmaznak az alkalikus foszfatáz, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, az oszteonektin, az oszteopontin és az 1-es típusú kollagén mennyiségi meghatározására.