Autogenne cząsteczki sygnałowe pochodzące z hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych jako wzmacniacze tworzenia kości w przeszczepach kostnych

1. Cele i hipotezy

   Opierając się na wcześniej zgłoszonych badaniach i stosując podejście translacyjne, hipoteza, że ​​efekt parakrynny związany z hodowanymi autogennymi czynnikami wzrostu i cytokinami w stężeniach fizjologicznych działających lokalnie w miejscach przeszczepu może promować szybszą i/lub bardziej wydajną odpowiedź komórkową, a w konsekwencji indukować bardziej znaczącą /uwzględniono szybsze tworzenie kości. Obecność tych cząsteczek dodanych do syntetycznych substytutów kości może pozytywnie wpływać na miejscową rekrutację komórek (chemotaksję), proliferację, różnicowanie i syntezę białek kostnych. Również powtarzające się zagrożenia biologiczne związane z konwencjonalnymi związkami do przeszczepów komórkowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej, zwykle związane z manipulacją komórkami ex vivo pod względem rakotwórczości, immunogenności i wcześniej zgłaszanego zjawiska odróżnicowania komórek, zostałyby złagodzone przez wykluczenie elementu komórkowego z tego procesu , ponieważ niektóre raporty uważają, że po sztucznym wyhodowaniu wykazują nieprzewidywalne zachowanie mitotyczne. Niniejsze badanie ma na celu dalsze rozszerzenie tego badania translacyjnego po badaniach przedklinicznych przeprowadzonych przez głównego badacza, proponując prospektywne randomizowane kontrolowane badanie kliniczne dotyczące możliwych korzyści związanych z zastosowaniem związku do przeszczepu kości opracowanego metodą inżynierii tkankowej, zawierającego skoncentrowaną autogeniczną pożywkę do hodowli komórkowych (CM ) oraz syntetyczny substytut kości na bazie hydroksyapatytu/beta-fosforanu trójwapniowego (ceramika HP/β-TCP). Konkretne cele obejmują analizę gęstości nowo utworzonej zwapnionej tkanki za pomocą tomografii komputerowej (CBCT), ekspresję swoistych immunohistochemicznych markerów kościotwórczych (RT-PCR) oraz histomorfometryczną ocenę ilości kości. W modelu badania podzielonej jamy ustnej wynikłe tworzenie się kości po przeszczepie HP/β-TCP z i bez CM zostanie przeanalizowane, porównane i określone ilościowo w różnych punktach czasowych.

2. Materiały i metody

2.1- Projekt studium

Prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne z podzielonymi ustami zostało wybrane jako projekt badania dla niniejszego badania. Po zatwierdzeniu protokołu przez Komisję ds. Etyki Badań i rejestracji na stronie klinicznych trials.gov platformy, zgodnie z wytycznymi CONSORT, 20 kolejnych pacjentów, którzy szukają rehabilitacji szczęki w Oddziale Stomatologii Protetycznej Szkoły Nauk o Zdrowiu i Przyrodnictwie - PUCRS, Brazylia, zostanie zaproszonych do udziału w obecnym badaniu.

2.2 – Pobieranie/hodowla lipoplastyki i ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (hASC).

W przypadku pobrania hASC zostanie zaproponowany i wykonany zabieg lipoplastyki brzucha po podpisaniu świadomej zgody. W sedacji dożylnej i dodatkowym uwalnianiu tlenu za pomocą cewnika doustnego, wraz ze znieczuleniem miejscowym, zostanie przeprowadzona standardowa chirurgiczna lipoplastyka. Jak opisano wcześniej, z tego materiału liposukcyjnego 25 do 30 ml tłuszczu zostanie przeniesione do 50 ml probówki Falcon. Tłuszcz zostanie następnie przemyty przez odwirowanie (430 μg przez 10 min), a górną warstwę tłuszczu przeniesie się do nowej probówki Falcon, gdzie do mieszaniny zostanie dodana taka sama objętość roztworu kolagenazy i inkubowana w temperaturze 37°C w wodzie wanna. Po odwirowaniu górna warstwa tłuszczu zostanie odrzucona, a supernatant usunięty. Pozostały osad komórkowy zawierający hASC zostanie ponownie zawieszony w 15 ml pożywki hodowlanej. Po dodaniu 15 ml ciepłej pożywki hodowlanej, zawiesinę komórek przenosi się do kolby hodowlanej T175. Komórki hASC będą inkubowane w wilgotnym środowisku w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnie osad komórkowy zostanie ponownie zawieszony w ciepłej pożywce hodowlanej i wysiany do nowych kolb do hodowli komórkowej.

2.3 - Przygotowanie i analiza skoncentrowanej pożywki hodowlanej (CM).

Hodowla komórek macierzystych i preparat CM zostaną przeprowadzone w zakładzie posiadającym certyfikat GMP dla produktów medycyny regeneracyjnej. Najpierw profile antygenów powierzchniowych izolowanych hASC w trzecim pasażu zostaną scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność markerów CD73, CD90, CD105 i CD44 oraz brak CD34, CD45, CD11b, CD19 i HLA-DR zostanie oceniona w celu potwierdzenia pożądanego fenotypu komórki zgodnie z zaleceniami protokołów Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej. Następnie próbka tych komórek zostanie również scharakteryzowana poprzez wybarwienie (Czerwień Alizarynowa S) zgodnie z zaleceniami producenta. Ekspansja komórek i CM zostaną wygenerowane zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórek macierzystych. Przed zastosowaniem klinicznym CM zostanie zbadany nie tylko pod kątem skażenia bakteriami, grzybami lub mykoplazmami, ale także pod kątem infekcji wirusami, w tym wirusami zapalenia wątroby typu B i C, ludzkim niedoborem odporności i ludzkimi wirusami białaczki T-komórkowej. Następnie CM będzie odpowiednio przechowywany w chłodnym miejscu i wysyłany do zastosowań klinicznych (do 6 godzin), aby uniknąć długotrwałej denaturacji/inaktywacji obecnych cząsteczek sygnałowych, jak sugerowano wcześniej.

2.4 - Procedura uniesienia dna zatoki szczękowej

W sedacji IV i dodatkowym uwalnianiu tlenu za pomocą cewnika doustnego, wraz ze znieczuleniem miejscowym, kość szczękowa zostanie wszczepiona wewnętrznie poprzez wywiercenie dostępu w bocznej ścianie zatoki szczękowej. Przeprowadzona zostanie również preparacja błony zatokowej z ostrożnym uwolnieniem i uniesieniem. Randomizacja przedoperacyjna za pomocą generowanych komputerowo liczb losowych zostanie wykorzystana do określenia zatok testowych i kontrolnych dla każdego pacjenta. Dno kostne zatoki szczękowej w miejscu badania zostanie wzmocnione 4 do 5 g syntetycznego substytutu kości (BoneCeramic™ 1-2 mm) zmieszanego z 10 do 15 ml CM. Miejsce kontrolne otrzyma podobną ilość substytutu kości zatopionego w 10 do 15 ml roztworu soli fizjologicznej. Pacjenci będą wypisywani ze szpitala 2h po zabiegu. Zostaną poinstruowani w zakresie higieny pooperacyjnej i zachowań żywieniowych. Wszyscy pacjenci otrzymają pooperacyjną terapię antybiotykową i przeciwzapalną.

2.5 - Wszczepianie implantów i pobieranie biopsji kości

Po 6 miesiącach gojenia implant zostanie umieszczony zgodnie z rutynowymi protokołami chirurgicznymi, zgodnie z zaleceniami producenta implantu. W znieczuleniu miejscowym zostanie wykonane linijne nacięcie środkowego wyrostka i płat pełnej grubości z uwolnieniem nacięć w razie potrzeby. Następnie, z kątnicą 16:1 przymocowaną do jednostki chirurgicznej i wiertłem trepanacyjnym (Ø 3 mm), obszar przeszczepu odpowiadający regionom 2. przedtrzonowca, 1. i 2. trzonowca zostanie poddany biopsji zarówno po prawej, jak i po lewej stronie szczęki (n=06 miejsc na pacjenta), prowadzony przez wcześniej wykonany stent chirurgiczny z żywicy akrylowej. Biopsje kości zostaną następnie podzielone na dwa segmenty, z których jeden będzie przechowywany w 4% roztworze formaldehydu do analizy histologicznej, a drugi w fiolkach Eppendorfa z RNALater do analizy RT-PCR. Następnie przestrzegana będzie kolejność implantacji wierteł chirurgicznych zalecana przez producenta w celu umieszczenia od 6 do 8 implantów na pacjenta. Rejestracja pierwotnej stabilności podczas wkładania będzie wykonywana zarówno ręcznym kluczem dynamometrycznym, jak i podzielona na trzy grupy. Następnie osadzony zostanie łącznik gojący, a rana zostanie zamknięta niewchłanialnym materiałem szewnym. Dla wszystkich implantów zostanie przyjęty 6-miesięczny jednoetapowy protokół gojenia.

2.6 - Analiza obrazu CBCT

Obrazy CBCT o wysokiej rozdzielczości zostaną uzyskane w trzech różnych punktach czasowych w ramach protokołu leczenia, tj. przed operacją przeszczepu kości [linia wyjściowa], 90 [T1] i 180 [T2] dni (wszczepienie implantu przed operacją), mając na celu zarówno przedoperacyjne planowanie chirurgiczne, jak i pooperacyjną ocenę tworzenia kości. Morfometryczne parametry kości zostaną obliczone w analizie 3D zgodnie z zaleceniami Amerykańskiego Towarzystwa Badań Kości i Minerałów (ASBMR), jak wcześniej zaproponowano, a analiza statystyczna zostanie wykorzystana do określenia najlepszych kombinacji parametrów mających na celu zróżnicowanie kości beleczkowej na trzy kości kategorie: (i) rzadka związana z luźną strukturą kości, (ii) pośrednia związana z dobrze zbudowaną kością beleczkową oraz (iii) gęsta kość związana z masywnym obszarem kości z małą przestrzenią między beleczkami.

2.7 - Analizy histologiczne i histomorfometryczne

Po usunięciu biopsji przeszczepu w miejscu umieszczenia implantu, bloczki kostne zawierające kontrolne i testowe miejsca kości zostaną ukształtowane i odwapnione za pomocą 5% HNO3. Bloki odwodnią się w stopniowanej serii alkoholowej, sklarują ksylenem i zostaną zatopione w żywicy. Następnie żywica będzie polimeryzowana w komorze UV ​​przez 10h. Za pomocą mikropiły diamentowej w sumie trzy plastry o grubości 3 μm z każdego bloku zostaną zeszlifowane poprzecznie do długiej osi każdej próbki w odległości 50, 100 i 150 μm od ich zewnętrznej części. Następnie zostanie przeprowadzone rutynowe barwienie hematoksyliną-eozyną (HE), Azur II i pararozaniliną w celu odróżnienia cząstek HP/β-TCP od nowo utworzonej kości. Analiza mikroskopowa zostanie przeprowadzona przy powiększeniu 24x przy użyciu stereoskopowego mikroskopu optycznego podłączonego do aparatu cyfrowego. Analiza obrazu zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania ImageJ®.

2.8 - Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

Po przygotowaniu zebranych biopsji przeszczepu do ekstrakcji RNA, zostanie zastosowana analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w celu ilościowego oznaczenia fosfatazy alkalicznej, czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, osteonektyny, osteopontyny i kolagenu typu 1.