골이식에서 골형성 촉진제로서의 자가 중간엽 줄기세포 배양 유래 신호분자

1. 목적과 가설

   이전에 보고된 연구를 기반으로 번역 접근법에 따라 이식된 부위에서 국소적으로 작용하는 생리학적 농도에서 배양된 자가 성장 인자 및 사이토카인과 연결된 주변분비 효과가 더 빠르고/또는 더 효율적인 세포 반응을 촉진하고 결과적으로 더 중요한 /빠른 뼈 형성이 고려되었습니다. 합성 뼈 대체물에 첨가된 이러한 분자의 존재는 국소 세포 모집(주화성), 증식, 분화 및 뼈 단백질 합성 측면에서 긍정적으로 작용할 수 있습니다. 또한 종양형성, 면역원성 및 이전에 보고된 세포 탈분화 현상 측면에서 세포의 체외 조작과 일반적으로 연결된 기존의 조직 공학 세포 이식 화합물과 관련된 반복적인 생물학적 위험은 이 과정의 세포 요소를 배제함으로써 완화될 것입니다. , 일단 인위적으로 배양되면 예측할 수 없는 유사분열 행동을 나타내는 것으로 일부 보고서에서 간주되기 때문입니다. 본 연구는 농축 자가 세포 배양 배지(CM ) 및 하이드록실아파타이트/베타-인산삼칼슘계 합성 뼈 대체물(HP/β-TCP 세라믹). 구체적인 목적에는 컴퓨터 단층 촬영(CBCT)에 의한 새로 형성된 석회화 조직의 밀도에 대한 분석, 특정 면역조직화학적 골 형성 마커(RT-PCR)의 발현 및 조직 형태학적 골량 평가가 포함됩니다. split-mouth 연구 모델에서 CM이 있거나 없는 HP/β-TCP 이식 후 결과적인 뼈 형성이 다른 시점에서 분석, 비교 및 ​​정량화됩니다.

2. 재료 및 방법

2.1- 연구 설계

전향적인 구강 분할 무작위 통제 임상 시험이 현재 조사를 위한 연구 설계로 선택되었습니다. 연구윤리위원회 의정서 승인 및 임상시험 등록 후 플랫폼, CONSORT 지침에 따라 브라질 PUCRS의 보건 생명 과학 대학 보철 치과에서 상악 구강 재활을 원하는 20명의 연속 환자가 현재 조사에 참여하도록 초대됩니다.

2.2 - 지방 성형술 및 인간 지방 줄기 세포(hASC) 수확/배양.

hASC 수확의 경우 복부 지방성형술 절차가 제안되고 서명된 동의서에 따라 수행됩니다. 국소 마취와 함께 구강 카테터를 사용한 정맥 진정 및 보충 산소 방출하에 표준 외과 지방 성형술 기술이 수행됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 이 지방 흡입 재료에서 25~30ml의 지방이 50ml Falcon 튜브로 옮겨집니다. 그런 다음 지방을 원심분리(430Å~g 10분)로 세척하고 상부 지방층을 새로운 Falcon 튜브로 옮기고 동량의 콜라게나제 용액을 혼합물에 첨가하고 물에서 37°C로 배양합니다. 욕조. 원심 분리 후 상부 지방층을 버리고 상층액을 제거합니다. hASC를 포함하는 나머지 세포 펠릿은 15ml의 배양 배지로 재현탁됩니다. 따뜻한 배양 배지 15ml를 첨가한 후 세포 현탁액을 T175 배양 플라스크로 옮깁니다. hASC는 37°C 및 5% CO2의 습한 환경에서 배양됩니다. 그런 다음, 세포 펠릿은 따뜻한 배양 배지에 재현탁되고 새로운 세포 배양 플라스크에 시드됩니다.

2.3 - 농축 배양 배지(CM) 준비 및 분석

줄기 세포 배양 및 CM 준비는 재생 의약품에 대한 GMP 인증 시설에서 수행됩니다. 처음에는 세 번째 계대에서 분리된 hASC의 표면 항원 프로필을 유세포 분석으로 특징지을 것입니다. CD73, CD90, CD105 및 CD44 마커의 존재와 CD34, CD45, CD11b, CD19 및 HLA-DR의 부재를 평가하여 국제 세포 치료 협회의 프로토콜에서 권장하는 대로 원하는 세포 표현형을 확인합니다.[ 그런 다음 이들 세포의 샘플도 제조업체의 지침에 따라 염색(Alizarin Red S)으로 특성화됩니다. 세포 확장 및 CM은 표준 줄기 세포 배양 프로토콜에 따라 생성됩니다. 임상 사용 전에 CM은 박테리아, 진균 또는 마이코플라즈마 오염뿐만 아니라 B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 및 인간 T세포 백혈병 바이러스를 포함한 바이러스 감염 여부를 검사합니다. 그런 다음 CM은 이전에 제안된 대로 현재 신호 분자의 장기 변성/비활성화를 피하기 위해 적절하게 냉각 저장되고 임상 적용(최대 6시간)으로 전송됩니다.

2.4 - 상악동저거상술

국소 마취와 함께 구강 카테터를 사용한 IV 진정 및 보충 산소 방출하에 상악골은 외측 상악동 벽에 구멍을 뚫어 내부적으로 이식됩니다. 조심스럽게 릴리스 및 거상과 함께 부비동 막 해부도 수행됩니다. 컴퓨터 생성 난수에 의한 수술 전 무작위화를 사용하여 각 환자에 대한 테스트 및 제어 부비동을 결정합니다. 테스트 부위의 상악동 골저에는 CM 10~15ml와 혼합된 합성 뼈 대체물(BoneCeramic™ 1-2mm) 4~5g이 보강됩니다. 제어 부위는 10~15ml의 식염수에 내장된 유사한 양의 뼈 대체물을 받게 됩니다. 환자는 수술 후 2시간 후에 병원 시설에서 퇴원합니다. 그들은 수술 후 위생과 식습관에 대해 교육을 받을 것입니다. 모든 환자는 수술 후 항생제 및 항염증 치료를 받게 됩니다.

2.5 - 임플란트 배치 및 뼈 생검 수확

치유 6개월 후 임플란트 식립은 임플란트 제조업체에서 권장하는 일상적인 수술 프로토콜을 따릅니다. 국소마취 하에 절개선 중간선 절개와 전층 피판을 시행하고 필요할 때마다 절개를 해제합니다. 그 후 16:1의 콘트라앵글을 수술부에 부착하고 Trephine Bur(Ø 3mm)로 제2소구치, 제1대구치, 제2대구치에 해당하는 이식 부위를 상악 좌우 양쪽에서 생검합니다. (n=환자당 06개 부위), 이전에 제작된 아크릴 수지 수술용 스텐트에 의해 유도됨. 그런 다음 뼈 생검을 두 부분으로 나누어 하나는 조직학적 분석을 위해 4% 포름알데히드 용액에 보관하고 다른 하나는 RT-PCR 분석을 위해 RNALater가 포함된 Eppendorf 바이알에 보관합니다. 그런 다음 제조업체에서 권장하는 임플란트 외과용 버의 순서에 따라 환자당 6~8개의 임플란트를 식립합니다. 삽입 시 1차 안정성의 등록은 수동 토크렌치로 이루어지며 세 그룹으로 분류됩니다. 그런 다음 치유 지대주를 배치하고 비흡수성 봉합사 재료로 상처 봉합을 실시합니다. 모든 임플란트에 대해 6개월 1단계 치유 프로토콜이 채택됩니다.

2.6 - CBCT 이미지 분석

고해상도 CBCT 이미지는 수술 전 뼈 이식[기준선], 90[T1] 및 180[T2]일(수술 전 임플란트 식립)을 의미하는 치료 프로토콜의 일부로 세 가지 다른 시점에서 얻을 수 있습니다. 뼈 형성에 대한 수술 전 수술 계획과 수술 후 평가를 모두 목표로 합니다. 이전에 제안된 ASBMR(American Society for Bone and Mineral Research)의 권장 사항에 따라 형태학적 뼈 매개변수를 3D 분석으로 계산하고 통계 분석을 사용하여 소주골을 3개의 뼈로 구분하는 것을 목표로 하는 최상의 매개변수 조합을 식별합니다. 범주: (i) 느슨한 뼈 구조와 관련된 희소형, (ii) 잘 구조화된 소주골과 관련된 중간형, 및 (iii) 소주 사이에 공간이 거의 없는 거대한 뼈 영역과 관련된 조밀한 뼈 유형.

2.7 - 조직학적 및 조직형학적 분석

임플란트 식립 시 이식 생검을 제거한 후 대조군과 테스트 뼈 부위를 포함하는 뼈 블록이 형성되고 5% HNO3로 탈회됩니다. 블록은 등급이 매겨진 알코올 시리즈에서 탈수되고 자일렌으로 투명해지고 수지에 내장됩니다. 그런 다음 수지는 UV 광 챔버에서 10시간 동안 중합됩니다. 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 각 블록에서 총 3개의 3μm 두께 슬라이스가 외부 부분에서 50, 100 및 150μm에서 각 시편 장축에 대해 가로로 연마됩니다. 그 후 HP/β-TCP 입자와 새로 형성된 뼈를 구별하기 위해 hematoxylin-eosin(HE), Azur II 및 Pararosaniline을 사용한 일상적인 염색이 수행됩니다. 현미경 분석은 디지털 카메라에 연결된 광학 스테레오 현미경을 사용하여 24X 배율로 수행됩니다. 이미지 분석은 ImageJ® 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.

2.8 - 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)

RNA 추출을 위해 수집된 이식편 생검을 준비한 후 실시간 역전사효소-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석을 적용하여 알칼리성 인산분해효소, 혈관 내피 성장 인자, Osteonectin, Osteopontin 및 1형 콜라겐을 정량화합니다.