Moléculas de sinalização derivadas de cultura de células-tronco mesenquimais autógenas como intensificadores da formação óssea em enxerto ósseo

1. Objetivos e Hipóteses

   Com base em estudos previamente relatados e seguindo uma abordagem translacional, uma hipótese de que o efeito parácrino associado a fatores de crescimento autógenos cultivados e citocinas em concentrações fisiológicas atuando localmente em locais enxertados pode promover uma resposta celular mais rápida e/ou eficiente e, conseqüentemente, induzir uma resposta mais significativa /formação óssea mais rápida foi considerada. A presença dessas moléculas adicionadas aos substitutos ósseos sintéticos pode atuar positivamente em termos de recrutamento celular local (quimiotaxia), proliferação, diferenciação e síntese de proteínas ósseas. Além disso, os riscos biológicos recorrentes envolvidos em compostos de enxerto celular de engenharia de tecidos convencionais, geralmente ligados à manipulação ex vivo de células em termos de tumorigenicidade, imunogenicidade e o fenômeno de desdiferenciação celular relatado anteriormente, seriam mitigados pela exclusão do elemento celular desse processo , pois são considerados por alguns relatos como apresentando comportamento mitótico imprevisível quando cultivados artificialmente. O presente estudo visa estender ainda mais esta investigação translacional após estudos pré-clínicos do investigador principal, propondo um ensaio clínico controlado randomizado prospectivo sobre os possíveis benefícios associados à aplicação de um composto de enxerto ósseo de engenharia de tecidos contendo meio concentrado de cultura de células autógenas (CM ) e um substituto ósseo sintético à base de hidroxilapatita/beta-tricálcio fosfato (cerâmica HP/β-TCP). Os objetivos específicos incluem análises da densidade do tecido calcificado recém-formado por tomografia computadorizada (CBCTs), expressão de marcadores imuno-histoquímicos específicos de formação óssea (RT-PCR) e avaliação histomorfométrica da quantidade óssea. Em um modelo de estudo de boca dividida, a formação óssea resultante após o enxerto de HP/β-TCP com e sem CM será analisada, comparada e quantificada em diferentes momentos.

2. Materiais e métodos

2.1- Desenho do estudo

Um ensaio clínico randomizado controlado prospectivo de boca dividida foi escolhido como desenho de estudo para a presente investigação. Após aprovação do protocolo pelo Comitê de Ética em Pesquisa e registro no Clinical Trials.gov plataforma, seguindo as diretrizes do CONSORT, 20 pacientes consecutivos que buscam reabilitação oral superior no Departamento de Odontologia Protética da Faculdade de Saúde e Ciências da Vida - PUCRS, Brasil, serão convidados a participar da presente investigação.

2.2 - Lipoplastia e colheita/cultura de células estaminais adiposas humanas (hASCs).

Para a colheita de hASCs, um procedimento de lipoplastia abdominal será proposto e realizado após um consentimento informado assinado. Sob sedação intravenosa e liberação de oxigênio suplementar com cateter oral, juntamente com anestesia local, será realizada uma técnica cirúrgica de lipoplastia padrão. Conforme descrito anteriormente, desse material de lipoaspiração, serão transferidos 25 a 30 ml de gordura para um tubo Falcon de 50 ml. A gordura será então lavada por centrifugação (430Å~g 10 min), sendo a camada superior de gordura transferida para um novo tubo Falcon, onde igual volume de solução de colagenase será adicionada à mistura e incubada a 37°C em água banho. Após a centrifugação, a camada superior de gordura será descartada e o sobrenadante removido. O pellet celular restante contendo as hASCs será ressuspenso com 15 ml de meio de cultura. Após a adição de 15 ml de meio de cultura morno, a suspensão de células será transferida para um frasco de cultura T175. As hASCs serão incubadas em ambiente umidificado a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, o pellet celular será ressuspenso em meio de cultura quente e semeado em novos frascos de cultura celular.

2.3 - Preparação e análise do meio de cultura concentrado (CM)

A cultura de células-tronco e a preparação CM serão realizadas em uma instalação certificada GMP para produtos de medicina regenerativa. Inicialmente, os perfis de antígenos de superfície das hASCs isoladas na terceira passagem serão caracterizados por citometria de fluxo. A presença de marcadores CD73, CD90, CD105 e CD44 e a ausência de CD34, CD45, CD11b, CD19 e HLA-DR serão avaliadas para confirmar o fenótipo celular desejado, conforme recomendado pelos protocolos da Sociedade Internacional de Terapia Celular.[ Em seguida, uma amostra dessas células também será caracterizada por coloração (Alizarin Red S) de acordo com as instruções do fabricante. A expansão celular e o CM serão gerados seguindo os protocolos padrão de cultura de células-tronco. Antes do uso clínico, o CM será examinado não apenas quanto à contaminação por bactérias, fungos ou micoplasmas, mas também quanto à infecção por vírus, incluindo vírus da hepatite B e C, imunodeficiência humana e leucemia de células T humanas. Em seguida, os CM serão devidamente armazenados em refrigeração e encaminhados para aplicação clínica (até 6 horas), para evitar a desnaturação/inativação a longo prazo das moléculas sinalizadoras presentes, conforme sugerido anteriormente.

2.4 - Procedimento de elevação do assoalho do seio maxilar

Sob sedação IV e liberação de oxigênio suplementar com cateter oral, juntamente com anestesia local, o osso maxilar será enxertado internamente por meio de perfuração de um acesso na parede lateral do seio maxilar. A dissecção da membrana sinusal com liberação e elevação cuidadosas também será realizada. A randomização pré-operatória por números aleatórios gerados por computador será usada para determinar os seios de teste e controle de cada paciente. O assoalho ósseo do seio maxilar no local do teste será aumentado com 4 a 5 g de um substituto ósseo sintético (BoneCeramic™ 1-2 mm) misturado com 10 a 15 ml de CM. O local controle receberá quantidade semelhante de substituto ósseo embebido em 10 a 15 ml de solução salina. Os pacientes terão alta hospitalar 2h após a cirurgia. Eles serão instruídos sobre higiene pós-operatória e comportamento alimentar. Todos os pacientes receberão antibióticos pós-operatórios e terapias anti-inflamatórias.

2.5 - Colocação de implantes e colheita de biópsias ósseas

Após 6 meses de cicatrização, a colocação do implante seguirá os protocolos cirúrgicos de rotina recomendados pelo fabricante do implante. Sob anestesia local, será realizada incisão linear mesocrestal e retalho de espessura total com incisões liberadoras sempre que necessário. Em seguida, com um contra-ângulo 16:1 acoplado a uma unidade cirúrgica e uma broca trefina (Ø 3mm), a área enxertada correspondente às regiões de 2º pré-molar, 1º e 2º molar será biopsiada em ambos os lados direito e esquerdo da maxila (n=06 sítios por paciente), guiados por um stent cirúrgico de resina acrílica previamente confeccionado. As biópsias ósseas serão então divididas em dois segmentos, onde um será armazenado em solução de formaldeído a 4% para análise histológica e o outro em frascos Eppendorf com RNALater para análise por RT-PCR. Em seguida, será seguida a sequência de brocas cirúrgicas de implantes recomendadas pelo fabricante para a colocação de 6 a 8 implantes por paciente. O registro da estabilidade primária na inserção será feito por torquímetro manual e classificado em três grupos. Um pilar de cicatrização será então colocado e o fechamento da ferida será conduzido com material de sutura não reabsorvível. Um protocolo de cicatrização de 6 meses em um estágio será adotado para todos os implantes.

2.6 - Análise de imagem CBCT

Imagens de CBCT de alta resolução serão obtidas em três momentos diferentes como parte do protocolo de tratamento, ou seja, no enxerto ósseo pré-operatório [linha de base], 90 [T1] e 180 [T2] dias (colocação do implante pré-operatório), visando tanto o planejamento cirúrgico pré-operatório quanto a avaliação pós-operatória da formação óssea. Os parâmetros morfométricos ósseos serão calculados em análise 3D de acordo com as recomendações da American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) como proposto anteriormente, e a análise estatística será utilizada para identificar as melhores combinações de parâmetros visando diferenciar o osso trabecular em três ossos categorias: (i) esparso relacionado a uma estrutura óssea frouxa, (ii) intermediário relacionado a um osso trabecular bem estruturado e (iii) tipo de osso denso relacionado a uma área óssea maciça com pouco espaço entre as trabéculas.

2.7 - Análises histológicas e histomorfométricas

Após a remoção das biópsias de enxerto na colocação do implante, os blocos ósseos contendo os locais de osso de controle e teste serão moldados e descalcificados com 5% de HNO3. Os blocos serão desidratados em uma série graduada de álcool, clarificados com xileno e embutidos em resina. Em seguida, a resina será polimerizada em câmara de luz ultravioleta por 10h. Utilizando uma microsserra diamantada, um total de três fatias de 3 μm de espessura de cada bloco serão retificadas transversalmente ao longo eixo de cada corpo de prova a 50, 100 e 150 μm de sua porção externa. Após isso, será realizada a coloração de rotina com hematoxilina-eosina (HE), Azur II e pararosanilina visando a diferenciação entre partículas de HP/β-TCP e osso neoformado. A análise microscópica será realizada em aumento de 24X usando um estereomicroscópio óptico conectado a uma câmera digital. A análise das imagens será realizada por meio do software ImageJ®.

2.8 - Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR)

Após a preparação das biópsias de enxerto coletadas para extração de RNA, a análise em tempo real da reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) será aplicada para quantificar fosfatase alcalina, fator de crescimento endotelial vascular, osteonectina, osteopontina e colágeno tipo 1.