Aus autogenen mesenchymalen Stammzellkulturen gewonnene Signalmoleküle als Verstärker der Knochenbildung bei der Knochentransplantation

1. Ziele und Hypothese

   Basierend auf zuvor berichteten Studien und nach einem translationalen Ansatz, eine Hypothese, dass der parakrine Effekt in Verbindung mit kultivierten autogenen Wachstumsfaktoren und Zytokinen in physiologischen Konzentrationen, die lokal an transplantierten Stellen wirken, eine schnellere und/oder effizientere Zellreaktion fördern und folglich eine signifikantere induzieren könnte /schnellere Knochenbildung wurde berücksichtigt. Das Vorhandensein dieser Moleküle, die synthetischen Knochenersatzstoffen zugesetzt werden, könnte sich positiv auf die lokale Zellrekrutierung (Chemotaxis), Proliferation, Differenzierung und Knochenproteinsynthese auswirken. Auch wiederkehrende biologische Gefahren, die mit konventionellen, durch Gewebezüchtung hergestellten Zelltransplantatverbindungen verbunden sind, die normalerweise mit der Ex-vivo-Manipulation von Zellen in Bezug auf Tumorigenität, Immunogenität und das zuvor berichtete Phänomen der Zelldedifferenzierung verbunden sind, würden durch den Ausschluss des Zellelements aus diesem Prozess gemildert , da einige Berichte davon ausgehen, dass sie ein unvorhersehbares mitotisches Verhalten aufweisen, sobald sie künstlich kultiviert wurden. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, diese translationale Untersuchung nach präklinischen Studien des Hauptforschers weiter auszubauen, und schlägt eine prospektive, randomisierte, kontrollierte klinische Studie zu den möglichen Vorteilen vor, die mit der Anwendung einer aus Gewebe gewonnenen Knochentransplantatverbindung verbunden sind, die konzentriertes autogenes Zellkulturmedium (CM ) und ein synthetisches Knochenersatzmaterial auf Basis von Hydroxylapatit/beta-Trikalziumphosphat (HP/β-TCP-Keramik). Konkrete Ziele sind Analysen zur Dichte des neu gebildeten kalzifizierten Gewebes mittels Computertomographie (DVT), Expression spezifischer immunhistochemischer Knochenbildungsmarker (RT-PCR) und histomorphometrische Knochenmengenbestimmung. In einem Split-Mouth-Studienmodell wird die resultierende Knochenbildung nach HP/β-TCP-Transplantation mit und ohne CM zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert, verglichen und quantifiziert.

2. Materialen und Methoden

2.1- Studiendesign

Als Studiendesign für die vorliegende Untersuchung wurde eine prospektive, randomisierte, kontrollierte klinische Split-Mouth-Studie gewählt. Nach Genehmigung des Protokolls durch das Research Ethics Committee und Registrierung bei Clinical Trials.gov Plattform werden gemäß den CONSORT-Richtlinien 20 konsekutive Patienten, die eine orale Oberkieferrehabilitation an der Abteilung für prothetische Zahnheilkunde der School of Health and Life Sciences (PUCRS, Brasilien) anstreben, zur Teilnahme an der vorliegenden Untersuchung eingeladen.

2.2 – Lipoplastie und Gewinnung/Kultur menschlicher Fettstammzellen (hASCs).

Für die Entnahme von hASCs wird eine abdominale Lipoplastie vorgeschlagen und nach einer unterzeichneten Einverständniserklärung durchgeführt. Unter intravenöser Sedierung und zusätzlicher Sauerstofffreisetzung mit einem oralen Katheter wird zusammen mit örtlicher Betäubung eine chirurgische Standard-Lipoplastiktechnik durchgeführt. Von diesem Liposuktionsmaterial werden, wie zuvor beschrieben, 25 bis 30 ml Fett in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt. Das Fett wird dann durch Zentrifugation (430 Åg 10 min) gewaschen, wobei die obere Fettschicht in ein neues Falcon-Röhrchen überführt wird, wo ein gleiches Volumen Kollagenaselösung zu der Mischung hinzugefügt und bei 37°C in Wasser inkubiert wird Bad. Nach der Zentrifugation wird die obere Fettschicht verworfen und der Überstand entfernt. Das verbleibende Zellpellet, das die hASCs enthält, wird mit 15 ml Kulturmedium resuspendiert. Nach Zugabe von 15 ml warmem Kulturmedium wird die Zellsuspension in eine T175-Kulturflasche überführt. Die hASCs werden in einer befeuchteten Umgebung bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wird das Zellpellet in warmem Kulturmedium resuspendiert und in neue Zellkulturflaschen ausgesät.

2.3 - Vorbereitung und Analyse von konzentriertem Kulturmedium (CM).

Stammzellkultur und CM-Präparation werden in einer GMP-zertifizierten Einrichtung für Produkte der regenerativen Medizin durchgeführt. Zunächst werden die Oberflächenantigenprofile isolierter hASCs bei der dritten Passage mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Das Vorhandensein von CD73-, CD90-, CD105- und CD44-Markern und das Fehlen von CD34, CD45, CD11b, CD19 und HLA-DR wird bewertet, um den gewünschten Zellphänotyp gemäß den Empfehlungen der Protokolle der International Society of Cellular Therapy zu bestätigen. Dann wird eine Probe dieser Zellen ebenfalls durch Färbung (Alizarin Red S) gemäß den Anweisungen des Herstellers charakterisiert. Zellexpansion und CM werden nach Standard-Stammzellkulturprotokollen erzeugt. Vor dem klinischen Einsatz wird CM nicht nur auf Kontamination mit Bakterien, Pilzen oder Mykoplasmen untersucht, sondern auch auf Infektionen mit Viren, darunter Hepatitis B und C, humane Immunschwäche- und humane T-Zell-Leukämie-Viren. Dann wird CM ordnungsgemäß kühl gelagert und zur klinischen Anwendung geschickt (bis zu 6 Stunden), um eine langfristige Denaturierung/Inaktivierung vorhandener Signalmoleküle zu vermeiden, wie zuvor vorgeschlagen.

2.4 - Verfahren zur Elevation des Kieferhöhlenbodens

Unter intravenöser Sedierung und zusätzlicher Sauerstoffabgabe mit einem oralen Katheter, zusammen mit örtlicher Betäubung, wird der Oberkieferknochen intern augmentiert, indem ein Zugang in die seitliche Kieferhöhlenwand gebohrt wird. Eine Dissektion der Sinusmembran mit vorsichtiger Freisetzung und Elevation wird ebenfalls durchgeführt. Präoperative Randomisierung durch computergenerierte Zufallszahlen wird verwendet, um Test- und Kontrollnebenhöhlen für jeden Patienten zu bestimmen. Der knöcherne Boden der Kieferhöhle an der Teststelle wird mit 4 bis 5 g eines synthetischen Knochenersatzmaterials (BoneCeramic™ 1-2 mm) gemischt mit 10 bis 15 ml CM augmentiert. Die Kontrollstelle erhält eine ähnliche Menge Knochenersatz eingebettet in 10 bis 15 ml Kochsalzlösung. Die Patienten werden 2 Stunden nach der Operation aus der Krankenhauseinrichtung entlassen. Sie werden in postoperativer Hygiene und Essverhalten unterwiesen. Alle Patienten erhalten postoperative antibiotische und entzündungshemmende Therapien.

2.5 - Implantatinsertion und Entnahme von Knochenbiopsien

Nach 6 Monaten Einheilung erfolgt die Implantatinsertion gemäß den vom Implantathersteller empfohlenen routinemäßigen chirurgischen Protokollen. Unter örtlicher Betäubung wird eine lineare Inzision in der Mitte der Krestalen und ein Lappen in voller Dicke durchgeführt, wobei bei Bedarf Entlastungsinzisionen durchgeführt werden. Dann wird mit einem 16:1-Winkelstück, das an einer chirurgischen Einheit befestigt ist, und einem Trepanbohrer (Ø 3 mm) der transplantierte Bereich, der den Regionen des 2. Prämolaren, 1. und 2. Molaren entspricht, auf der rechten und linken Seite des Oberkiefers biopsiert (n = 06 Stellen pro Patient), geführt durch einen zuvor hergestellten chirurgischen Stent aus Acrylharz. Die Knochenbiopsien werden dann in zwei Segmente geteilt, von denen eines in 4 %iger Formaldehydlösung für die histologische Analyse und das andere in Eppendorf-Fläschchen mit RNALater für die RT-PCR-Analyse gelagert wird. Dann wird die vom Hersteller empfohlene Reihenfolge der implantatchirurgischen Bohrer für die Platzierung von 6 bis 8 Implantaten pro Patient befolgt. Die Registrierung der Primärstabilität beim Einsetzen erfolgt sowohl mit einem manuellen Drehmomentschlüssel als auch in drei Gruppen eingeteilt. Anschließend wird ein Gingivaformer platziert und der Wundverschluss mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial durchgeführt. Für alle Implantate wird ein 6-monatiges einzeitiges Einheilprotokoll angewendet.

2.6 - DVT-Bildanalyse

Hochauflösende CBCT-Bilder werden zu drei verschiedenen Zeitpunkten als Teil des Behandlungsprotokolls erhalten, d. h. zum präoperativen Knochentransplantat [Basislinie], 90 [T1] und 180 [T2] Tage (Implantatinsertion präoperativ), Ziel ist sowohl die präoperative chirurgische Planung als auch die postoperative Beurteilung der Knochenbildung. Die morphometrischen Knochenparameter werden in einer 3D-Analyse gemäß den Empfehlungen der American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) berechnet, wie zuvor vorgeschlagen, und eine statistische Analyse wird verwendet, um die besten Parameterkombinationen zu identifizieren, die darauf abzielen, trabekulären Knochen in drei Knochen zu differenzieren Kategorien: (i) spärlich im Zusammenhang mit einer lockeren Knochenstruktur, (ii) intermediär im Zusammenhang mit einem gut strukturierten trabekulären Knochen und (iii) dichte Knochentypen im Zusammenhang mit einem massiven Knochenbereich mit wenig Platz zwischen den Trabekeln.

2.7 - Histologische und histomorphometrische Analysen

Nach der Entnahme der Transplantatbiopsien bei der Implantatinsertion werden die Knochenblöcke, die die Kontroll- und Testknochenstellen enthalten, geformt und mit 5 % HNO3 entkalkt. Die Blöcke werden in einer abgestuften Alkoholreihe entwässert, mit Xylol geklärt und in Harz eingebettet. Anschließend wird das Harz 10 h in einer UV-Lichtkammer polymerisiert. Unter Verwendung einer Diamantmikrosäge werden insgesamt drei 3 μm dicke Scheiben von jedem Block quer zur Längsachse jeder Probe bei 50, 100 und 150 μm von ihrem äußeren Teil geschliffen. Danach erfolgt eine routinemäßige Färbung mit Hämatoxylin-Eosin (HE), Azur II und Pararosanilin mit dem Ziel, zwischen HP/β-TCP-Partikeln und neu gebildetem Knochen zu unterscheiden. Die mikroskopische Analyse wird bei 24-facher Vergrößerung unter Verwendung eines optischen Stereomikroskops durchgeführt, das mit einer Digitalkamera verbunden ist. Die Bildanalyse wird mit der ImageJ®-Software durchgeführt.

2.8 - Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Nach der Vorbereitung der gesammelten Transplantatbiopsien für die RNA-Extraktion wird eine Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (RT-PCR) in Echtzeit durchgeführt, um die alkalische Phosphatase, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, Osteonectin, Osteopontin und Typ-1-Kollagen zu quantifizieren.