Autogene mesenkymale stamcellekultur-avledede signalmolekyler som forsterkere av bendannelse ved bentransplantasjon

1. Mål og hypotese

   Basert i tidligere rapporterte studier og etter en translasjonstilnærming, kan en hypotese om at den parakrine effekten knyttet til dyrkede autogene vekstfaktorer og cytokiner ved fysiologiske konsentrasjoner som virker lokalt på transplanterte steder fremme en raskere og/eller mer effektiv cellerespons og følgelig indusere en mer signifikant /raskere beindannelse ble vurdert. Tilstedeværelsen av disse molekylene lagt til syntetiske benerstatninger kan virke positivt når det gjelder lokal celle rekruttering (kjemotaksi), proliferasjon, differensiering og benproteinsyntese. Også tilbakevendende biologiske farer involvert i konvensjonelle vevskonstruerte cellulære graftforbindelser, vanligvis knyttet til ex vivo-manipulasjon av celler når det gjelder tumorigenisitet, immunogenisitet og det tidligere rapporterte celle-dedifferensieringsfenomenet, vil bli redusert ved å ekskludere celleelementet i denne prosessen , ettersom de av noen rapporter anses å presentere uforutsigbar mitotisk oppførsel når de først er kunstig dyrket. Den nåværende studien tar sikte på å utvide denne translasjonsundersøkelsen ytterligere etter prekliniske studier av hovedetterforskeren, og foreslår en prospektiv randomisert kontrollert klinisk studie på mulige fordeler forbundet med påføring av en vevskonstruert bentransplantatforbindelse som inneholder konsentrert autogent celledyrket medium (CM ) og en hydroksylapatitt/beta-trikalsiumfosfatbasert syntetisk benerstatning (HP/β-TCP-keramikk). Spesifikke mål inkluderer analyser av tettheten til det nydannede forkalkede vevet ved hjelp av computertomografi (CBCT), ekspresjon av spesifikke immunhistokjemiske bendannelsesmarkører (RT-PCR) og histomorfometrisk benkvantitetsevaluering. I en studiemodell med delt munn vil den resulterende bendannelsen etter HP/β-TCP-transplantasjon med og uten CM analyseres, sammenlignes og kvantifiseres på forskjellige tidspunkt.

2. Materialer og metoder

2.1- Studiedesign

En prospektiv delt munn randomisert kontrollert klinisk studie ble valgt som studiedesign for denne undersøkelsen. Etter protokollgodkjenning av forskningsetisk komité og registrering hos clinical trials.gov plattform, etter CONSORT-retningslinjene, vil 20 påfølgende pasienter som søker maxillær oral rehabilitering ved Institutt for protetisk odontologi ved School of Health and Life Sciences - PUCRS, Brasil, bli invitert til å delta i denne undersøkelsen.

2.2 - Lipoplastikk og humane fettstamceller (hASCs) høsting/kultur.

For hASC-høsting vil en abdominal lipoplastikkprosedyre bli foreslått og utført etter et signert informert samtykke. Under intravenøs sedasjon og supplerende oksygenfrigjøring med et oralt kateter, sammen med lokalbedøvelse, vil en standard kirurgisk lipoplastikk-teknikk bli utført. Som tidligere beskrevet, fra dette fettsugingsmaterialet, vil 25 til 30 ml fett overføres til et 50 ml Falcon-rør. Fettet vil deretter vaskes ved sentrifugering (430Å~g 10 min), som er det øvre fettlaget overført til et nytt Falcon-rør, hvor et likt volum av kollagenaseløsning vil tilsettes blandingen og inkuberes ved 37°C i vann. bad. Etter sentrifugering vil det øvre fettlaget bli kastet og supernatanten fjernet. Den gjenværende cellepelleten som inneholder hASC-ene vil bli resuspendert med 15 ml kulturmedium. Etter tilsetning av 15 ml varmt kulturmedium, overføres cellesuspensjonen til en T175 kulturkolbe. HASC-ene vil bli inkubert i et fuktig miljø ved 37 °C og 5 % CO2. Deretter vil cellepelleten resuspenderes i varmt kulturmedium og sås inn i nye cellekulturkolber.

2.3 - Klargjøring og analyse av konsentrert kulturmedium (CM).

Stamcellekultur og CM-preparering vil bli utført ved et GMP-sertifisert anlegg for regenerative medisinprodukter. Til å begynne med vil overflateantigenprofilene til isolerte hASC-er ved tredje passasje være preget av flowcytometri. Tilstedeværelsen av CD73, CD90, CD105 og CD44 markører og fraværet av CD34, CD45, CD11b, CD19 og HLA-DR vil bli vurdert for å bekrefte ønsket cellefenotype som anbefalt av protokoller fra International Society of Cellular Therapy.[ Deretter vil en prøve av disse cellene også karakteriseres ved farging (Alizarin Red S) i henhold til produsentens instruksjoner. Celleekspansjon og CM vil bli generert etter standard stamcellekulturprotokoller. Før klinisk bruk vil CM bli undersøkt ikke bare for kontaminering med bakterier, sopp eller mykoplasma, men også for infeksjon med virus inkludert hepatitt B og C, human immunsvikt og humane T-celle leukemivirus. Deretter vil CM bli riktig kjølelagret og sendt til klinisk bruk (opptil 6 timer), for å unngå langsiktig denaturering/inaktivering av nåværende signalmolekyler, som tidligere foreslått.

2.4 - Prosedyre for heving av gulv i maksillær sinus

Under IV sedasjon og supplerende oksygenfrigjøring med et oralt kateter, sammen med lokalbedøvelse, vil maksillærbenet transplanteres internt ved å bore en tilgang i lateral maksillær sinusvegg. Sinus membran disseksjon med forsiktig frigjøring og elevasjon vil også bli utført. Preoperativ randomisering ved hjelp av datamaskingenererte tilfeldige tall vil bli brukt for å bestemme test og kontroll bihuler for hver pasient. Det benete gulvet i sinus maxillaris på teststedet vil bli forsterket med 4 til 5 g av en syntetisk benerstatning (BoneCeramic™ 1-2 mm) blandet med 10 til 15 ml CM. Kontrollstedet vil motta tilsvarende mengde benerstatning innebygd i 10 til 15 ml saltvannsløsning. Pasienter vil bli løslatt fra sykehuset 2 timer etter operasjonen. De vil bli instruert i postoperativ hygiene og spiseatferd. Alle pasienter vil motta postoperativ antibiotika og antiinflammatorisk behandling.

2.5 - Implantatplassering og innhøsting av benbiopsier

Etter 6 måneders tilheling vil implantatplassering følge rutinemessige kirurgiske protokoller som anbefalt av implantatprodusenten. Under lokalbedøvelse vil et lineært snitt midt-krestal og klaffe i full tykkelse utføres med frigjørende snitt når det er nødvendig. Deretter, med en vinkelvinkel på 16:1 festet til en kirurgisk enhet og en trefinbor (Ø 3 mm), vil det podede området som korresponderer med 2. premolar, 1. og 2. molar region bli biopsiert på både høyre og venstre side av maxilla (n=06 steder per pasient), ledet av en tidligere laget kirurgisk stent i akrylharpiks. Benbiopsier vil deretter bli delt i to segmenter, hvor den ene lagres i 4 % formaldehydløsning for histologisk analyse og den andre i Eppendorf-ampuller med RNALater for RT-PCR-analyse. Deretter vil sekvensen for kirurgiske implantater som anbefalt av produsenten følges for plassering av 6 til 8 implantater per pasient. Registrering av primær stabilitet ved innsetting vil gjøres med både manuell momentnøkkel og klassifiseres i tre grupper. Et helbredende distanse vil deretter bli plassert, og sårlukking vil bli utført med ikke-resorberbart suturmateriale. En 6-måneders ett-trinns tilhelingsprotokoll vil bli tatt i bruk for alle implantater.

2.6 - CBCT bildeanalyse

Høyoppløselige CBCT-bilder vil bli tatt på tre forskjellige tidspunkter som en del av behandlingsprotokollen, dvs. ved preoperativt beintransplantat [baseline], 90 [T1] og 180 [T2] dager (implantatplassering preoperativt), sikte på både pre-operativ kirurgisk planlegging og post-op evaluering av beindannelsen. De morfometriske beinparametrene vil bli beregnet i 3D-analyse i henhold til anbefalingene fra American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR) som tidligere foreslått, og statistisk analyse vil bli brukt for å identifisere de beste parameterkombinasjonene som tar sikte på å differensiere trabekulært bein til tre bein. kategorier: (i) sparsomt relatert til en løs benstruktur, (ii) mellomrelatert til et godt strukturert trabekulært ben, og (iii) tette bentyper relatert til et massivt beinområde med lite mellomrom mellom trabeculae.

2.7 - Histologiske og histomorfometriske analyser

Etter fjerning av graftbiopsier ved implantatplassering, vil benblokker som inneholder kontroll- og testbeinstedene formes og avkalkes med 5 % HNO3. Blokkene vil dehydrere i en gradert alkoholserie, klarne med xylen og legges inn i harpiks. Deretter vil harpiksen polymeriseres i et UV-lyskammer i 10 timer. Ved hjelp av en diamantmikrosag vil totalt tre 3 μm tykke skiver fra hver blokk slipes på tvers av hver prøves langakse på 50, 100 og 150 μm fra deres ytre del. Etter dette vil rutinefarging med hematoxylin-eosin (HE), Azur II og Pararosanilin bli gjort med sikte på å skille mellom HP/β-TCP-partikler og nydannet bein. Mikroskopisk analyse vil bli utført ved 24X forstørrelse ved bruk av et optisk stereomikroskop koblet til et digitalkamera. Bildeanalyse vil bli utført ved hjelp av ImageJ®-programvaren.

2.8 - Sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

Etter klargjøring av de innsamlede podebiopsiene for RNA-ekstraksjon, vil sanntids revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)-analyse bli brukt for å kvantifisere alkalisk fosfatase, vaskulær endotelial vekstfaktor, Osteonectin, Osteopontin og type 1 kollagen.