Signální molekuly odvozené z autogenních mezenchymálních kmenových buněk jako urychlovače tvorby kosti při štěpování kostí

1. Cíle a hypotézy

   Na základě dříve publikovaných studií a po translačním přístupu, hypotéza, že parakrinní účinek spojený s kultivovanými autogenními růstovými faktory a cytokiny ve fyziologických koncentracích působících lokálně v místech roubování může podporovat rychlejší a/nebo účinnější buněčnou odpověď a následně vyvolat významnější /uvažovalo se o rychlejší tvorbě kostí. Přítomnost těchto molekul přidaných k syntetickým kostním náhradám může působit pozitivně ve smyslu lokálního získávání buněk (chemotaxe), proliferace, diferenciace a syntézy kostních proteinů. Také opakující se biologická rizika spojená s konvenčními tkáňovými inženýrskými sloučeninami buněčných štěpů, obvykle spojená s manipulací buněk ex vivo, pokud jde o tumorigenicitu, imunogenicitu a dříve uváděný fenomén buněčné dediferenciace, by byla zmírněna vyloučením buněčného prvku tohoto procesu. , protože jsou podle některých zpráv považovány za prezentující nepředvídatelné mitotické chování, jakmile byly uměle vypěstovány. Tato studie si klade za cíl dále rozšířit toto translační zkoumání po preklinických studiích hlavního výzkumníka a navrhuje prospektivní randomizovanou kontrolovanou klinickou studii o možných přínosech spojených s aplikací sloučeniny kostního štěpu upraveného tkáňovým inženýrstvím obsahující koncentrované médium pro kultivaci autogenních buněk (CM ) a syntetická kostní náhrada na bázi hydroxylapatitu/beta-trikalciumfosfátu (HP/β-TCP keramika). Specifické cíle zahrnují analýzy hustoty nově vytvořené kalcifikované tkáně pomocí počítačové tomografie (CBCT), exprese specifických imunohistochemických markerů kostní formace (RT-PCR) a histomorfometrické hodnocení kostní kvantity. V modelu studie s rozdělenými ústy bude výsledná tvorba kosti po transplantaci HP/β-TCP s a bez CM analyzována, porovnána a kvantifikována v různých časových bodech.

2. Materiály a metody

2.1- Návrh studie

Jako design studie pro toto šetření byla vybrána prospektivní randomizovaná kontrolovaná klinická studie s rozdělenými ústy. Po schválení protokolu Etickou komisí pro výzkum a registraci na webu Clinical Trials.gov platformě, v souladu s pokyny CONSORT, bude 20 po sobě jdoucích pacientů, kteří vyhledávají maxilární orální rehabilitaci na katedře protetické stomatologie School of Health and Life Sciences - PUCRS, Brazílie, pozváno k účasti na tomto šetření.

2.2 - Lipoplastika a sklizeň/kultivace lidských adipózních kmenových buněk (hASC).

Pro odběr hASC bude navržen a proveden postup abdominální lipoplastiky po podepsaném informovaném souhlasu. Za intravenózní sedace a dodatečného uvolňování kyslíku perorálním katétrem spolu s lokální anestezií bude provedena standardní chirurgická lipoplastická technika. Jak již bylo popsáno výše, z tohoto liposukčního materiálu se 25 až 30 ml tuku přenese do 50 ml zkumavky Falcon. Tuk se poté promyje odstředěním (430 Å~g 10 min), přičemž se horní vrstva tuku přenese do nové Falconovy zkumavky, kde se ke směsi přidá stejný objem roztoku kolagenázy a inkubuje se při 37 °C ve vodě. koupel. Po odstředění bude horní tuková vrstva odstraněna a supernatant odstraněn. Zbývající buněčná peleta obsahující hASC se resuspenduje s 15 ml kultivačního média. Po přidání 15 ml teplého kultivačního média se buněčná suspenze přenese do kultivační baňky T175. hASC budou inkubovány ve vlhkém prostředí při 37 °C a 5 % CO2. Poté bude buněčná peleta resuspendována v teplém kultivačním médiu a naočkována do nových lahví pro kultivaci buněk.

2.3 - Příprava a analýza koncentrovaného kultivačního média (CM).

Kultivace kmenových buněk a příprava KM budou prováděny v zařízení s certifikací GMP pro produkty regenerativní medicíny. Nejprve budou profily povrchových antigenů izolovaných hASC při třetí pasáži charakterizovány průtokovou cytometrií. Přítomnost markerů CD73, CD90, CD105 a CD44 a nepřítomnost markerů CD34, CD45, CD11b, CD19 a HLA-DR bude posouzena pro potvrzení požadovaného buněčného fenotypu podle doporučení protokolů Mezinárodní společnosti pro buněčnou terapii.[ Poté bude vzorek těchto buněk také charakterizován barvením (Alizarin Red S) v souladu s pokyny výrobce. Buněčná expanze a CM budou generovány podle standardních protokolů kultivace kmenových buněk. Před klinickým použitím bude CM vyšetřena nejen na kontaminaci bakteriemi, houbami nebo mykoplazmaty, ale také na infekci viry včetně hepatitidy B a C, lidské imunodeficience a viry lidské T-buněčné leukémie. Poté bude KM řádně uskladněna v chladu a odeslána ke klinické aplikaci (až 6 hodin), aby se zabránilo dlouhodobé denaturaci/inaktivaci přítomných signálních molekul, jak bylo navrženo dříve.

2.4 - Postup elevace dna maxilárního sinu

Při IV sedaci a dodatečném uvolňování kyslíku perorálním katétrem, spolu s lokální anestezií, bude maxilární kost interně transplantována vyvrtáním přístupu do laterální stěny maxilárního sinu. Bude také provedena disekce sinusové membrány s pečlivým uvolněním a elevací. Předoperační randomizace pomocí počítačově generovaných náhodných čísel bude použita k určení testovacích a kontrolních dutin pro každého pacienta. Kostní dno maxilárního sinu na testovaném místě bude rozšířeno 4 až 5 g syntetické kostní náhrady (BoneCeramic™ 1-2 mm) smíchané s 10 až 15 ml CM. Kontrolní místo dostane podobné množství kostní náhrady vložené do 10 až 15 ml fyziologického roztoku. Pacienti budou propuštěni z nemocničního zařízení 2 hodiny po operaci. Budou poučeni o pooperační hygieně a stravovacím chování. Všichni pacienti dostanou pooperační antibiotickou a protizánětlivou terapii.

2.5 - Umístění implantátu a odběr kostních biopsií

Po 6 měsících hojení se bude umístění implantátu řídit rutinními chirurgickými protokoly podle doporučení výrobce implantátu. V lokální anestezii bude provedena střední krestální lineární incize a lalok v plné tloušťce s uvolňujícími řezy, kdykoli to bude nutné. Poté, s kolénkem 16:1 připojeným k chirurgické jednotce a trepanovou frézou (Ø 3 mm), bude provedena biopsie oblasti štěpu odpovídající oblasti 2. premoláru, 1. a 2. moláru na pravé i levé straně maxily. (n=06 míst na pacienta), vedené dříve vyrobeným chirurgickým stentem z akrylové pryskyřice. Kostní biopsie pak budou rozděleny do dvou segmentů, kde jeden bude uložen ve 4% formaldehydovém roztoku pro histologickou analýzu a druhý v Eppendorfových lahvičkách s RNALater pro analýzu RT-PCR. Poté bude sledována sekvence implantátových chirurgických fréz podle doporučení výrobce pro umístění 6 až 8 implantátů na pacienta. Registrace primární stability při vkládání bude provedena jak ručním momentovým klíčem, tak rozdělena do tří skupin. Poté bude umístěn hojivý pilíř a bude provedeno uzavření rány neresorbovatelným šicím materiálem. Pro všechny implantáty bude přijat 6měsíční jednofázový protokol hojení.

2.6 - Analýza obrazu CBCT

CBCT snímky s vysokým rozlišením budou získány ve třech různých časových bodech jako součást léčebného protokolu, což znamená v předoperačním kostním štěpu [výchozí hodnota], 90 [T1] a 180 [T2] dnech (umístění implantátu před operací), zaměřené jak na předoperační chirurgické plánování, tak na pooperační hodnocení tvorby kosti. Morfometrické parametry kosti budou vypočteny v 3D analýze podle doporučení Americké společnosti pro výzkum kostí a minerálů (ASBMR), jak bylo navrženo dříve, a statistická analýza bude použita k identifikaci nejlepších kombinací parametrů s cílem diferencovat trabekulární kost na tři kosti. kategorie: (i) řídké související s volnou kostní strukturou, (ii) střední související s dobře strukturovanou trabekulární kostí a (iii) husté typy kostí související s masivní kostní oblastí s malým prostorem mezi trabekuly.

2.7 - Histologické a histomorfometrické analýzy

Po odstranění biopsií štěpu při umístění implantátu budou kostní bloky obsahující kontrolní a testovací místa kosti tvarovány a odvápněny 5% HNO3. Bloky se dehydratují v řadě odstupňovaných alkoholů, vyčeří se xylenem a zalijí se do pryskyřice. Poté bude pryskyřice polymerována v komoře s UV světlem po dobu 10 hodin. Pomocí diamantové mikropilky budou celkem tři plátky o tloušťce 3 μm z každého bloku nabroušeny příčně ke každé dlouhé ose vzorku ve vzdálenosti 50, 100 a 150 μm od jejich vnější části. Poté bude provedeno rutinní barvení hematoxylinem-eosinem (HE), Azur II a pararosanilinem s cílem odlišit částice HP/β-TCP a nově vytvořenou kost. Mikroskopická analýza bude provedena při 24násobném zvětšení pomocí optického stereomikroskopu připojeného k digitální kameře. Analýza obrazu bude provedena pomocí softwaru ImageJ®.

2.8 - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR)

Po přípravě odebraných biopsií štěpu pro extrakci RNA bude použita analýza reverzní transkriptáza-polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) v reálném čase ke kvantifikaci alkalické fosfatázy, vaskulárního endoteliálního růstového faktoru, osteonektinu, osteopontinu a kolagenu 1. typu.