1 型糖尿病における SARS-CoV-2 感染症 / COVID-19 に対する免疫反応の特徴付け (TIRID)

目的と目的 このプロジェクトの目的は、1 型糖尿病 (T1D) を発症した回復期患者における、SARS-CoV-2 感染およびその他の一般的な感染症に対する宿主免疫応答を経時的に理解することです。 予備データは、2019年以前にT1Dを発症した患者の糖尿病原性T細胞がSARS-CoV-2やその他の一般的なヒト病原体を認識できることを示している。 逆が真であれば、SARS-CoV-2 またはいくつかの一般的な感染症に続いて T1D が発症するためのもっともらしいメカニズムが提供されることになります。 私たちは、感染後に T1D を発症する人がいる理由を突き止めたいと考えています。

主な目的は、感染後にT1Dを発症した個人がT1Dと関連することが知られているHLA A*0201およびHLA*2402遺伝子を保有しているかどうかを判定し、これらの個人のSARS-CoV-2/病原体特異的キラーT細胞が感染していることを示すことである。インスリンを産生する膵臓ベータ細​​胞を直接破壊することができます。 病原体特異的 T 細胞が糖尿病誘発性 T 細胞エピトープを認識する能力は、ペプチド HLA マルチマーを使用して検査されます。 交差反応性 T 細胞受容体は、SARS-CoV-2 およびその他の一般的な感染因子がどのように T1D を誘発するかを理解できるようにする生物物理学的および構造解析用に製造されます。

方法論では、サンプルのごく一部をこれらの HLA に対する抗体で染色することにより、T1D を発症した回復期患者がヒト白血球抗原 (HLA) HLA A*02 および HLA*24 を主に発現しているかどうかを検査します。 研究者らは、これらの疾患リスク HLA が大幅に濃縮される可能性があると予想しています (これらの疾患リスク対立遺伝子のいずれかを発現する患者の 75% 以上) [2]。 T細胞ライブラリー[3]およびペプチド-HLA多量体[4-6]アプローチは、HLA A*02およびHLA*24を介してSARS-CoV-2および他の一般的な病原体からエピトープを認識するT細胞を単離するために使用される。 生成されたモノクローナル T 細胞集団は、ヒト膵臓ベータ細​​胞の表面に存在する既知の糖尿病誘発性エピトープの認識についてテストされます。 このような T 細胞交差反応性 [7] が特定された場合、チームは同族 T 細胞受容体の相補性決定領域を配列決定し、さらなる生物物理学および構造研究 [9、 10] は、SARS-CoV-2 およびその他の一般的な病原体が少数の人に T1D をどのように誘発するかを理解することを目的としています。

研究は前向き観察研究となります。 参加者は、最近新たに 1 型糖尿病と診断された回復期患者 (n=30) です。 適格な参加者は、Cwm Taf Morgannwg 大学小児保健局のコンサルタント小児内分泌専門医から特定され、紹介されます。全員が臨床研究研究チームと直接の臨床治療チームの一員です。 すべての参加者とその保護者は、参加者情報シートを受け取り、内容を読んで理解するための時間とプライバシーを確​​保します。 Good Clinical Practiceの訓練を受けた研究チームのメンバーがサポートを提供し、あらゆる質問に答えます。 その後、インフォームド・コンセントは同意書に書面で取得され、小児参加者の場合は同意書と親/保護者の同意書に基づいて取得されます。 参加者には固有の研究番号が発行されます。

訓練を受けた瀉血専門医により、血液サンプルが 50 ml (子供の場合は参加者の体重に応じてそれ以下) 採取されます。 サンプルは匿名化され、固有の研究番号が発行されます。 採用当日に血液から末梢血単核球（PBMC）が必要になります。 匿名化された血液サンプルは、適切な UN3373 包装とともに、T 細胞研究および血清学検査 (UKAS 認定研究所での Roche SARS-CoV-2 IgM および IgG アッセイ) のための Cwm Taf 大学保健委員会研究所に転送されます。 サンプルは免疫学的、ウイルス学的および宿主遺伝子学的アッセイに使用されます。 血液は、宿主の RNA と DNA を含む血清と PBMC を分離するために処理されます。 T 細胞ライブラリーは PBMC を使用して確立されます。 生成された T 細胞クローンは、確立された糖尿病誘発性 T 細胞エピトープとの交差反応性についてテストされます。 T 細胞受容体 (TCR) は、さらなる研究のために交差反応性 T 細胞から製造される予定です。 PBMC サンプルは、フローサイトメトリーを使用して同族ペプチド-HLA マルチマーでも染色されます。 これにより、表現型と活性化ステータスに関する情報が生成されます。

素人の説明:

血液は、濃厚な密度勾配溶液と遠心分離機を使用して構成部分に分離されます。 白血球層 (PBMC) は、血液の他の部分から分離されて保持されます。 他の部分はすべて漂白剤溶液に捨てられます。PBMC はさらに処理されて T 細胞が分離され、これらの細胞は次の 5 つのルートのいずれかに進むことができます。

1. 細胞を処理して DNA/RNA を抽出し、DNA/RNA を分析して T 細胞受容体およびその他の関連分子に関する情報を取得します。 細胞は DNA/RNA 抽出中に死滅します。
2. 細胞は遺伝子編集を受けて、正常な T 細胞機能に関与するプロセスに関する情報を提供します。 細胞は遺伝子編集後 28 日間培養され、複数回の分裂を経て、2004 年ヒト組織局 (HTA) 法に準拠しなくなります。
3. これらの細胞は、SARS-CoV-2タンパク質の重複ビットに曝露されるアッセイに使用され、その後14日間培養で増殖し、その後細胞は分裂を起こし、HTAとは関係なくなります。 SARS-CoV-2タンパク質に反応する細胞は、インスリンを産生する膵臓ベータ細​​胞を破壊する能力があるかどうかを調べるために検査される。
4. 自動選別機と蛍光マーカーを使用して、細胞を選別して分析します。 細胞は、研究室で細胞が処理される日に行われるこのプロセス中に死滅します。
5. 細胞は、T 細胞の機能に関与するプロセスについて学ぶために、プレートベースのアッセイで使用されます。 細胞はアッセイ後に廃棄されますが、使用するアッセイの種類に応じて 1 ～ 3 日かかる場合があります。

この方法論は、社会的距離を保つためにリモートで実施された患者と一般の参加に基づいて設計されました。