SARS-CoV-2-infektion / COVID-19:n immuunivasteen karakterisointi tyypin 1 diabeteksessa (TIRID)

TAVOITTEET JA TAVOITTEET Tämän projektin tavoitteena on ymmärtää isännän immuunivastetta SARS-CoV-2-infektiolle ja muille yleisille infektioille ajan myötä toipilaspotilailla, joille kehittyy tyypin 1 diabetes (T1D). Alustavat tiedot osoittavat, että diabetogeeniset T-solut potilailla, joille kehittyi T1D ennen vuotta 2019, voivat tunnistaa SARS-CoV-2:n ja muita yleisiä ihmispatogeenejä. Jos päinvastainen on totta, se tarjoaisi uskottavan mekanismin T1D:n kehittymiselle SARS-CoV-2:n tai joidenkin yleisten infektioiden jälkeen. Haluaisimme selvittää, miksi joillekin ihmisille kehittyy T1D infektion jälkeen.

Ensisijaisena tavoitteena on määrittää, onko yksilöillä, joille kehittyy T1D infektion jälkeen, HLA A*0201- ja HLA*2402-geenit, joiden tiedetään liittyvän T1D:hen, ja osoittaa, että näiden yksilöiden SARS-CoV-2/patogeenispesifiset tappaja-T-solut ovat pystyy tuhoamaan suoraan insuliinia tuottavat haiman beetasolut. Patogeenispesifisten T-solujen kykyä tunnistaa diabetogeenisiä T-soluepitooppeja tutkitaan käyttämällä peptidi-HLA-multimeerejä. Ristireaktiivisia T-solureseptoreita valmistetaan biofysikaalisia ja rakenteellisia analyyseja varten, jotta voidaan ymmärtää, kuinka SARS-CoV-2 ja muut yleiset tartuntatautien aiheuttajat voivat indusoida T1D:tä.

Metodologialla tutkitaan, ilmentävätkö toipilaspotilaat, joille kehittyy T1D, pääasiassa ihmisen leukosyyttiantigeenejä (HLA:t) HLA A*02 ja HLA*24 värjäämällä pieni osa näytteestä näiden HLA:n vasta-aineilla. Tutkijat odottavat, että nämä sairausriskin HLA:t voivat rikastua huomattavasti (> 75 % potilaista, jotka ilmentävät jotakin näistä sairausriskialleeleista) [2]. T-solukirjaston [3] ja peptidi-HLA-multimeerin [4-6] lähestymistapoja käytetään sellaisten T-solujen eristämiseen, jotka tunnistavat epitooppeja SARS-CoV-2:sta ja muista yleisistä patogeeneista HLA A*02:n ja HLA*24:n kautta. Syntyneet monoklonaaliset T-solupopulaatiot testataan ihmisen haiman beetasolujen pinnalla olevien tunnettujen diabetogeenisten epitooppien tunnistamiseksi. Jos tällainen T-solujen ristireaktiivisuus [7] tunnistetaan, ryhmä sekvensoi T-solureseptorin komplementaarisuuden määräävän alueen, jotta se voidaan valmistaa liukoisena proteiinina [8] biofysikaalisia ja rakennetutkimuksia varten [9, 10], jonka tarkoituksena oli ymmärtää, kuinka SARS-CoV-2 ja muut yleiset patogeenit voivat aiheuttaa T1D:n vähemmistössä yksilöitä.

Tutkimus on prospektiivinen, havainnollinen tutkimus. Osallistujat ovat toipilaspotilaita, joilla on äskettäin uusi diagnoosi tyypin 1 diabetes (n = 30). Tukikelpoiset osallistujat tunnistavat ja ohjaavat konsultit Pediatric Endokrinologit Cwm Taf Morgannwg University Health Boardin lastenterveysosastosta, Cardiffin ja Valen terveyslautakunnan lastenterveysosastosta ja Lontoon St, Mary's Hospitalin lastenterveysosastosta. ovat kaikki osa kliinisen tutkimuksen tutkimusryhmää ja suoraa kliinistä hoitoa. Kaikki osallistujat ja heidän vanhempansa/huoltajansa saavat osallistujatietolomakkeen, ja heillä on aikaa ja yksityisyyttä lukea ja ymmärtää sisältöä. Hyvän kliinisen käytännön koulutettu tutkimusryhmän jäsen on käytettävissä antamaan tukea ja vastaamaan kaikkiin kysymyksiin. Tietoinen suostumus hankitaan sitten kirjallisesti suostumuslomakkeella tai lapsipotilaiden osalta suostumuslomakkeella ja vanhemman/huoltajan suostumuslomakkeella. Osallistujille myönnetään yksilöllinen tutkimusnumero.

Verinäytteen ottaa koulutettu flebotomi, 50 ml (tai vähemmän lapsilla osallistujan painon mukaan). Näyte anonymisoidaan ja sille annetaan yksilöllinen tutkimusnumero. Vaadimme perifeerisen veren mononukleaarisoluja (PBMC) verestä värväyspäivänä. Anonymisoidut verinäytteet siirretään T-solututkimukseen ja Cwm Taf University Health Board -laboratorioon serologisiin testeihin (Roche SARS-CoV-2 IgM- ja IgG-määritys UKAS-akkreditoidussa laboratoriossa) asianmukaisella UN3373-pakkauksella. Näytteitä käytetään immunologisiin, virologisiin ja isännän geneettisiin määrityksiin. Veri käsitellään seerumin ja PBMC:n eristämiseksi, mukaan lukien isännän RNA ja DNA. T-solukirjastot perustetaan käyttämällä PBMC:tä. Muodostettujen T-solukloonien ristireaktiivisuus testataan vakiintuneiden diabetogeenisten T-soluepitooppien kanssa. T-solureseptorit (TCR:t) valmistetaan ristiinreaktiivisista T-soluista lisätutkimuksia varten. PBMC-näytteet värjätään myös sukulaispeptidi-HLA-multimeereilla käyttämällä virtaussytometriaa. Tämä tuottaa tietoa niiden fenotyypistä ja aktivointitilasta.

Lay-kuvaus:

Veri erotetaan osiin käyttämällä paksua tiheysgradienttiliuosta ja sentrifugia. Valkosolukerros eli PBMC:t eristetään muista veren osista ja säilytetään. Kaikki muut osat heitetään pois valkaisuliuoksessa. PBMC-soluja käsitellään edelleen T-solujen eristämiseksi, ja nämä solut voivat sitten kulkea jollakin viidestä reitistä:

1. Solut käsitellään DNA/RNA:n erottamiseksi, ja DNA/RNA analysoidaan, jotta saadaan tietoa T-solureseptoreista ja muista niihin liittyvistä molekyyleistä. Solut tapetaan DNA/RNA-uuton aikana.
2. Soluille tehdään geneettinen muokkaus, jotta saadaan tietoa normaaliin T-solujen toimintaan liittyvistä prosesseista. Soluja viljellään 28 päivää geenien muokkauksen jälkeen, ne läpikäyvät useita jakautumiskierroksia, ja niistä tulee merkityksettömiä vuoden 2004 Human Tissue Authority (HTA) -lain kannalta.
3. Soluja käytetään määrityksessä, jossa ne altistetaan päällekkäisille SARS-CoV-2-proteiinien kappaleille, ja sitten niitä kasvatetaan viljelmässä 14 päivän ajan, jonka jälkeen solut ovat jakautuneet eivätkä ole enää HTA-merkityksillä. SARS-CoV-2-proteiineihin reagoivia soluja testataan sen selvittämiseksi, pystyvätkö ne tuhoamaan insuliinia tuottavia haiman beetasoluja.
4. Automaattisen lajittelijan ja fluoresoivien merkkiaineiden avulla solut lajitellaan ja analysoidaan. Solut kuolevat tämän prosessin aikana, joka tapahtuu sinä päivänä, jona solut käsitellään laboratoriossa.
5. Soluja käytetään levypohjaisissa määrityksissä T-solujen toimintoihin liittyvien prosessien oppimiseksi. Solut hävitetään määrityksen jälkeen, mikä voi kestää 1-3 päivää käytetyn määrityksen tyypistä riippuen.

Tämä menetelmä suunniteltiin potilaan ja yleisön osallistumisen perusteella, jotka toteutettiin etänä sosiaalisen etäisyyden vuoksi.