Karakterisering af immunresponset på SARS-CoV-2-infektion / COVID-19 ved type 1-diabetes (TIRID)

MÅL OG MÅL Formålet med dette projekt er at forstå værtens immunrespons på infektion med SARS-CoV-2 og andre almindelige infektioner over tid hos rekonvalescente patienter, der udvikler type 1-diabetes (T1D). Foreløbige data viser, at diabetogene T-celler hos patienter, der udviklede T1D før 2019, kan genkende SARS-CoV-2 og andre almindelige humane patogener. Hvis det omvendte er sandt, ville det give en plausibel mekanisme for udviklingen af ​​T1D efter SARS-CoV-2 eller nogle almindelige infektioner. Vi vil gerne finde ud af, hvorfor nogle mennesker udvikler T1D efter infektion.

Primære mål er at bestemme, om individer, der udvikler T1D efter infektion, bærer HLA A*0201- og HLA*2402-generne, der vides at være forbundet med T1D, og ​​at vise, at SARS-CoV-2/patogen-specifikke dræber-T-celler i disse individer er i stand til direkte at ødelægge insulinproducerende betaceller fra bugspytkirtlen. Patogen-specifikke T-cellers evne til at genkende diabetogene T-celle-epitoper vil blive undersøgt ved anvendelse af peptid-HLA-multimerer. Krydsreaktive T-celle-receptorer vil blive fremstillet til biofysiske og strukturelle analyser for at muliggøre en forståelse af, hvordan SARS-CoV-2 og andre almindelige smitsomme stoffer kan inducere T1D.

Metodologi vil undersøge, om rekonvalescente patienter, der udvikler T1D, overvejende udtrykker de humane leukocytantigener (HLA'er) HLA A*02 og HLA*24 ved at farve en lille del af prøven med antistoffer mod disse HLA. Forskere forudser, at der kan være en stor berigelse af disse sygdomsrisiko-HLA (>75 % af patienterne, der udtrykker en af ​​disse sygdomsrisiko-alleler) [2]. T-cellebibliotek [3] og peptid-HLA multimer [4-6] tilgange vil blive brugt til at isolere T-celler, der genkender epitoper fra SARS-CoV-2 og andre almindelige patogener via HLA A*02 og HLA*24. De genererede monoklonale T-cellepopulationer vil blive testet for genkendelse af kendte diabetogene epitoper, der er til stede på overfladen af ​​humane pancreas beta-celler. Hvor en sådan T-celle krydsreaktivitet [7] er identificeret, vil teamet sekventere den komplementaritetsbestemmende region af den beslægtede T-celle receptor, så den kan fremstilles som et opløseligt protein [8] til yderligere biofysiske og strukturelle undersøgelser [9, 10] rettet mod at forstå, hvordan SARS-CoV-2 og andre almindelige patogener kan inducere T1D hos et mindretal af individer.

Undersøgelsen vil være en prospektiv, observationsundersøgelse. Deltagerne vil være rekonvalescente patienter med nylig ny diagnose af type 1-diabetes (n=30). Kvalificerede deltagere vil blive identificeret og henvist fra konsulent pædiatriske endokrinologer ved Department of Child Health ved Cwm Taf Morgannwg University Health Board, The Department of Child Health, Cardiff og Vale Health Board og Department of Child Health, St, Mary's Hospital, London, som er alle en del af det kliniske forskningsstudieteam og det direkte kliniske plejeteam. Alle deltagere og deres forældre/værger vil modtage et deltagerinformationsark og have tid og privatliv til at læse og forstå indholdet. Et medlem af undersøgelsesteamet, der er uddannet i god klinisk praksis, vil være tilgængelig for at yde støtte og besvare eventuelle spørgsmål. Informeret samtykke vil derefter blive indhentet skriftligt på en samtykkeerklæring, eller i tilfælde af pædiatriske deltagere på en samtykkeerklæring og en samtykkeerklæring fra forældre/værge. Deltagerne vil få tildelt et unikt studienummer.

En blodprøve vil blive taget af en uddannet phlebotomist, 50 ml (eller mindre hos børn i henhold til deltagerens vægt). Prøven vil blive anonymiseret og udstedt med det unikke undersøgelsesnummer. Vi vil kræve perifere blod mononukleære celler (PBMC) fra blod på dagen for rekruttering. Anonymiserede blodprøver vil blive overført til T-celleforskning og Cwm Taf University Health Board laboratorium til serologiske tests (Roche SARS-CoV-2 IgM og IgG assay på et UKAS akkrediteret laboratorium) med passende UN3373 emballage. Prøver vil blive brugt til immunologiske, virologiske og værtsgenetiske assays. Blod vil blive behandlet for at isolere serum og PBMC, inklusive værts-RNA og -DNA. T-cellebiblioteker vil blive etableret ved hjælp af PBMC. T-celle kloner genereret vil blive testet for krydsreaktivitet med etablerede diabetogene T-celle epitoper. T-cellereceptorerne (TCR'er) vil blive fremstillet af krydsreaktive T-celler til yderligere undersøgelse. PBMC-prøver vil også blive farvet med beslægtede peptid-HLA-multimerer ved hjælp af flowcytometri. Dette vil generere information om deres fænotype og aktiveringsstatus.

En lay-beskrivelse:

Blodet vil blive adskilt i bestanddele ved hjælp af en tyk densitetsgradientopløsning og en centrifuge. Det hvide blodlegemelag, eller PBMC'er, isoleres fra andre dele af blodet og fastholdes. Alle andre dele kasseres i en blegeopløsning. PBMC'er behandles yderligere for at isolere T-cellerne, disse celler kan derefter gå ned ad en af ​​fem ruter:

1. Cellerne behandles for at udvinde DNA'et/RNA'et, og DNA'et/RNA'et analyseres for at få information om T-cellereceptorerne og andre associerede molekyler. Cellerne dræbes under DNA/RNA-ekstraktion.
2. Cellerne vil gennemgå genetisk redigering for at give information om de processer, der er involveret i normal T-cellefunktion. Celler vil blive dyrket i 28 dage efter genredigering, vil gennemgå flere delingsrunder og blive ikke-relevante i forhold til Human Tissue Authority (HTA) Act 2004.
3. Cellerne vil blive brugt i et assay, hvor de udsættes for overlappende bidder af SARS-CoV-2 proteiner, de vil derefter blive dyrket i kultur i 14 dage, hvorefter cellerne vil have gennemgået deling og ikke længere er MTV-relevante. Celler, der reagerer på SARS-CoV-2-proteiner, vil blive testet for at se, om de har kapacitet til at ødelægge insulinproducerende beta-celler fra bugspytkirtlen.
4. Ved hjælp af en automatiseret sorterer og fluorescerende markører sorteres og analyseres cellerne. Celler vil dø under denne proces, som finder sted den dag, celler behandles i laboratoriet.
5. Celler vil blive brugt i pladebaserede assays for at lære om processerne involveret i T-cellefunktioner. Celler vil blive bortskaffet efter analysen, hvilket kan tage mellem 1 og 3 dage afhængigt af den anvendte analysetype.

Denne metode blev designet efter Patient- og offentlig involvering, som blev udført eksternt på grund af social distancering.