Caractérisation de la réponse immunitaire à l'infection par le SRAS-CoV-2 / COVID-19 dans le diabète de type 1 (TIRID)

BUTS ET OBJECTIFS L'objectif de ce projet est de comprendre la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par le SRAS-CoV-2 et d'autres infections courantes au fil du temps chez les patients en convalescence qui développent un diabète de type 1 (DT1). Les données préliminaires montrent que les lymphocytes T diabétogènes chez les patients ayant développé un DT1 avant 2019 peuvent reconnaître le SRAS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes humains courants. Si l’inverse est vrai, cela fournirait un mécanisme plausible pour le développement du DT1 à la suite du SRAS-CoV-2 ou de certaines infections courantes. Nous aimerions comprendre pourquoi certaines personnes développent un DT1 après une infection.

Les principaux objectifs sont de déterminer si les individus qui développent un DT1 à la suite d'une infection portent les gènes HLA A*0201 et HLA*2402 connus pour être associés au DT1 et de montrer que les lymphocytes T tueurs du SRAS-CoV-2/spécifiques à l'agent pathogène chez ces individus sont capable de détruire directement les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline. La capacité des lymphocytes T spécifiques d'un pathogène à reconnaître les épitopes des lymphocytes T diabétogènes sera examinée à l'aide de multimères peptide-HLA. Des récepteurs de lymphocytes T à réaction croisée seront fabriqués pour des analyses biophysiques et structurelles afin de permettre de comprendre comment le SRAS-CoV-2 et d'autres agents infectieux courants pourraient induire le DT1.

La méthodologie examinera si les patients convalescents qui développent un DT1 expriment principalement les antigènes leucocytaires humains (HLA) HLA A*02 et HLA*24 en colorant une petite partie de l'échantillon avec des anticorps pour ces HLA. Les enquêteurs prévoient qu'il pourrait y avoir un enrichissement important pour ces allèles à risque de maladie (> 75 % des patients exprimant l'un de ces allèles à risque de maladie) [2]. Des approches de bibliothèque de lymphocytes T [3] et de multimère peptide-HLA [4-6] seront utilisées pour isoler les lymphocytes T qui reconnaissent les épitopes du SRAS-CoV-2 et d'autres agents pathogènes courants via HLA A*02 et HLA*24. Les populations de lymphocytes T monoclonaux générées seront testées pour la reconnaissance des épitopes diabétogènes connus présents à la surface des cellules bêta pancréatiques humaines. Lorsqu'une telle réactivité croisée des lymphocytes T [7] est identifiée, l'équipe séquencera la région déterminant la complémentarité du récepteur des lymphocytes T apparenté afin qu'elle puisse être fabriquée sous forme de protéine soluble [8] pour des études biophysiques et structurelles plus approfondies [9, 10] visait à comprendre comment le SRAS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes courants pourraient induire le DT1 chez une minorité d’individus.

L'étude sera une étude prospective et observationnelle. Les participants seront des patients en convalescence avec un nouveau diagnostic récent de diabète de type 1 (n = 30). Les participants éligibles seront identifiés et référés par des endocrinologues pédiatriques consultants du département de santé infantile du conseil de santé universitaire Cwm Taf Morgannwg, du département de santé infantile de Cardiff et du conseil de santé de Vale et du département de santé infantile de St, Mary's Hospital, Londres qui font tous partie de l’équipe d’étude de recherche clinique et de l’équipe de soins cliniques directe. Tous les participants et leurs parents/tuteurs recevront une fiche d'information du participant et auront le temps et l'intimité pour lire et comprendre le contenu. Un membre de l'équipe d'étude formé aux bonnes pratiques cliniques sera disponible pour fournir un soutien et répondre à toutes vos questions. Le consentement éclairé sera ensuite obtenu par écrit sur un formulaire de consentement, ou dans le cas des participants pédiatriques sur un formulaire d'assentiment et un formulaire de consentement du parent/tuteur. Les participants recevront un numéro d'étude unique.

Un échantillon de sang sera prélevé par un phlébotomiste qualifié, 50 ml (ou moins chez les enfants selon le poids du participant). L'échantillon sera anonymisé et recevra le numéro d'étude unique. Nous aurons besoin de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) provenant du sang le jour du recrutement. Des échantillons de sang anonymisés seront transférés pour la recherche sur les lymphocytes T et le laboratoire du Cwm Taf University Health Board pour les tests sérologiques (test Roche SARS-CoV-2 IgM et IgG dans un laboratoire accrédité UKAS) avec un emballage UN3373 approprié. Les échantillons seront utilisés pour des tests immunologiques, virologiques et génétiques de l'hôte. Les sangs seront traités pour isoler le sérum et les PBMC, y compris l'ARN et l'ADN de l'hôte. Des bibliothèques de lymphocytes T seront établies à l'aide du PBMC. Les clones de lymphocytes T générés seront testés pour leur réactivité croisée avec des épitopes de lymphocytes T diabétogènes établis. Les récepteurs des lymphocytes T (TCR) seront fabriqués à partir de lymphocytes T à réaction croisée pour une étude plus approfondie. Les échantillons de PBMC seront également colorés avec des multimères peptide-HLA apparentés par cytométrie en flux. Cela générera des informations sur leur phénotype et leur statut d’activation.

Une description profane :

Le sang sera séparé en éléments constitutifs à l’aide d’une solution à gradient de densité épais et d’une centrifugeuse. La couche de globules blancs, ou PBMC, est isolée des autres parties du sang et retenue. Toutes les autres parties sont jetées dans une solution d'eau de Javel. Les PBMC sont ensuite traitées pour isoler les lymphocytes T. Ces cellules peuvent ensuite emprunter l'une des cinq voies suivantes :

1. Les cellules sont traitées pour extraire l’ADN/ARN, et l’ADN/ARN est analysé pour obtenir des informations sur les récepteurs des lymphocytes T et d’autres molécules associées. Les cellules sont tuées lors de l’extraction d’ADN/ARN.
2. Les cellules subiront une modification génétique pour fournir des informations sur les processus impliqués dans le fonctionnement normal des lymphocytes T. Les cellules seront cultivées pendant 28 jours après l'édition génétique, subiront plusieurs cycles de division et deviendront non pertinentes au sens de la loi de 2004 sur la Human Tissue Authority (HTA).
3. Les cellules seront utilisées dans un test où elles sont exposées à des morceaux superposés de protéines du SRAS-CoV-2, elles seront ensuite cultivées pendant 14 jours, après quoi les cellules auront subi une division et ne seront plus pertinentes pour l'HTA. Les cellules qui répondent aux protéines du SRAS-CoV-2 seront testées pour voir si elles ont la capacité de détruire les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline.
4. À l’aide d’un trieur automatisé et de marqueurs fluorescents, les cellules sont triées et analysées. Les cellules mourront au cours de ce processus qui a lieu le jour où les cellules sont traitées en laboratoire.
5. Les cellules seront utilisées dans des tests sur plaques pour en savoir plus sur les processus impliqués dans les fonctions des lymphocytes T. Les cellules seront éliminées après le test, ce qui peut prendre entre 1 et 3 jours selon le type de test utilisé.

Cette méthodologie a été conçue suite à la participation des patients et du public, qui a été menée à distance en raison de la distanciation sociale.