Caratterizzazione della risposta immunitaria all'infezione da SARS-CoV-2/COVID-19 nel diabete di tipo 1 (TIRID)

SCOPI E OBIETTIVI L'obiettivo di questo progetto è comprendere la risposta immunitaria dell'ospite all'infezione da SARS-CoV-2 e altre infezioni comuni nel tempo nei pazienti convalescenti che sviluppano diabete di tipo 1 (T1D). I dati preliminari mostrano che le cellule T diabetogene nei pazienti che hanno sviluppato il T1D prima del 2019 possono riconoscere la SARS-CoV-2 e altri comuni patogeni umani. Se fosse vero il contrario, fornirebbe un meccanismo plausibile per lo sviluppo del T1D in seguito alla SARS-CoV-2 o ad alcune infezioni comuni. Vorremmo accertare perché alcune persone sviluppano il T1D dopo l’infezione.

Gli obiettivi primari sono determinare se gli individui che sviluppano il T1D a seguito di un'infezione portano i geni HLA A*0201 e HLA*2402 noti per essere associati al T1D e dimostrare che le cellule T killer SARS-CoV-2/patogeno-specifiche in questi individui sono in grado di distruggere direttamente le cellule beta pancreatiche produttrici di insulina. La capacità delle cellule T patogeno-specifiche di riconoscere gli epitopi delle cellule T diabetogene sarà esaminata utilizzando multimeri peptide-HLA. I recettori cross-reattivi delle cellule T saranno prodotti per analisi biofisiche e strutturali per consentire di comprendere come la SARS-CoV-2 e altri agenti infettivi comuni potrebbero indurre il T1D.

La metodologia esaminerà se i pazienti convalescenti che sviluppano T1D esprimono prevalentemente gli antigeni leucocitari umani (HLA) HLA A*02 e HLA*24 colorando una piccola parte del campione con anticorpi per questi HLA. I ricercatori prevedono che potrebbe esserci un grande arricchimento per questi HLA a rischio di malattia (>75% dei pazienti che esprimono uno di questi alleli a rischio di malattia) [2]. Verranno utilizzati approcci con librerie di cellule T [3] e multimeri peptide-HLA [4-6] per isolare le cellule T che riconoscono epitopi di SARS-CoV-2 e altri patogeni comuni tramite HLA A*02 e HLA*24. Le popolazioni di cellule T monoclonali generate verranno testate per il riconoscimento di epitopi diabetogeni noti presenti sulla superficie delle cellule beta pancreatiche umane. Laddove venga identificata tale reattività crociata delle cellule T [7], il team sequenziarà la regione che determina la complementarità del recettore affine delle cellule T in modo che possa essere prodotto come proteina solubile [8] per ulteriori studi biofisici e strutturali [9, 10] miravano a comprendere come la SARS-CoV-2 e altri agenti patogeni comuni potrebbero indurre il T1D in una minoranza di individui.

Lo studio sarà prospettico, osservazionale. I partecipanti saranno pazienti convalescenti con recente nuova diagnosi di diabete di tipo 1 (n = 30). I partecipanti idonei verranno identificati e indirizzati dai consulenti endocrinologi pediatrici presso il Dipartimento di salute infantile presso il comitato sanitario dell'Università Cwm Taf Morgannwg, il Dipartimento di salute infantile, Cardiff e il comitato sanitario di Vale e Dipartimento di salute infantile, St, Mary's Hospital, Londra che fanno tutti parte del team di studio di ricerca clinica e del team di assistenza clinica diretta. Tutti i partecipanti e i loro genitori/tutori riceveranno una scheda informativa sul partecipante e avranno tempo e privacy per leggere e comprendere il contenuto. Un membro del team di studio formato secondo la Buona Pratica Clinica sarà disponibile per fornire supporto e rispondere a qualsiasi domanda. Il consenso informato verrà quindi ottenuto per iscritto su un modulo di consenso o, nel caso di partecipanti pediatrici, su un modulo di consenso e su un modulo di consenso del genitore/tutore. Ai partecipanti verrà rilasciato un numero di studio univoco.

Un campione di sangue verrà prelevato da un flebotomista esperto, 50 ml (o meno nei bambini in base al peso del partecipante). Il campione verrà reso anonimo e gli verrà assegnato il numero univoco di studio. Avremo bisogno di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue il giorno del reclutamento. I campioni di sangue anonimizzati verranno trasferiti per la ricerca sulle cellule T e il laboratorio del Cwm Taf University Health Board per i test sierologici (test Roche SARS-CoV-2 IgM e IgG presso un laboratorio accreditato UKAS) con un appropriato imballaggio UN3373. I campioni verranno utilizzati per test immunologici, virologici e genetici dell'ospite. Il sangue verrà processato per isolare il siero e le PBMC, inclusi l'RNA e il DNA dell'ospite. Le librerie di cellule T verranno stabilite utilizzando il PBMC. I cloni di cellule T generati verranno testati per la reattività crociata con epitopi di cellule T diabetogeni consolidati. I recettori delle cellule T (TCR) saranno prodotti da cellule T cross-reattive per ulteriori studi. I campioni PBMC verranno inoltre colorati con multimeri affini peptide-HLA utilizzando la citometria a flusso. Ciò genererà informazioni sul loro fenotipo e sullo stato di attivazione.

Una descrizione laica:

Il sangue verrà separato nelle parti costituenti utilizzando una soluzione con gradiente di densità densa e una centrifuga. Lo strato di globuli bianchi, o PBMC, viene isolato da altre parti del sangue e trattenuto. Tutte le altre parti vengono scartate in una soluzione di candeggina. I PBMC vengono ulteriormente elaborati per isolare le cellule T, queste cellule possono quindi seguire uno dei cinque percorsi:

1. Le cellule vengono trattate per estrarre il DNA/RNA e il DNA/RNA viene analizzato per ottenere informazioni sui recettori delle cellule T e su altre molecole associate. Le cellule vengono uccise durante l'estrazione del DNA/RNA.
2. Le cellule verranno sottoposte a modifica genetica per fornire informazioni sui processi coinvolti nella normale funzione delle cellule T. Le cellule verranno coltivate per 28 giorni dopo la modifica genetica, saranno sottoposte a più cicli di divisione e diventeranno non rilevanti ai sensi della legge del 2004 dell'Autorità per i tessuti umani (HTA).
3. Le cellule verranno utilizzate in un test in cui saranno esposte a frammenti sovrapposti di proteine ​​SARS-CoV-2, verranno quindi coltivate in coltura per 14 giorni, dopodiché le cellule saranno state sottoposte a divisione e non saranno più rilevanti per l'HTA. Le cellule che rispondono alle proteine ​​SARS-CoV-2 saranno testate per vedere se hanno la capacità di distruggere le cellule beta pancreatiche produttrici di insulina.
4. Utilizzando un selezionatore automatizzato e marcatori fluorescenti, le cellule vengono selezionate e analizzate. Le cellule moriranno durante questo processo che avviene il giorno in cui vengono elaborate in laboratorio.
5. Le cellule verranno utilizzate in saggi su piastra per conoscere i processi coinvolti nelle funzioni delle cellule T. Le cellule verranno smaltite dopo il test che può richiedere da 1 a 3 giorni a seconda del tipo di test utilizzato.

Questa metodologia è stata progettata seguendo il coinvolgimento del paziente e del pubblico, condotto a distanza a causa del distanziamento sociale.