Характеристика иммунного ответа на инфекцию SARS-CoV-2/COVID-19 при диабете 1 типа (TIRID)

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ Целью данного проекта является понимание иммунного ответа хозяина на заражение SARS-CoV-2 и другими распространенными инфекциями с течением времени у выздоравливающих пациентов, у которых развивается диабет 1 типа (СД1). Предварительные данные показывают, что диабетогенные Т-клетки у пациентов, у которых развился СД1 до 2019 года, могут распознавать SARS-CoV-2 и другие распространенные у человека патогены. Если верно обратное, это может обеспечить правдоподобный механизм развития СД1 после SARS-CoV-2 или некоторых распространенных инфекций. Мы хотели бы выяснить, почему у некоторых людей после заражения развивается СД1.

Основная цель состоит в том, чтобы определить, имеют ли люди, у которых развивается СД1 после инфекции, гены HLA A*0201 и HLA*2402, которые, как известно, связаны с СД1, и показать, что Т-клетки-киллеры, специфичные для SARS-CoV-2/патогена, у этих людей Способен непосредственно разрушать бета-клетки поджелудочной железы, продуцирующие инсулин. Способность патоген-специфичных Т-клеток распознавать диабетогенные Т-клеточные эпитопы будет исследована с использованием мультимеров пептид-HLA. Перекрестно-реактивные Т-клеточные рецепторы будут производиться для биофизического и структурного анализа, чтобы понять, как SARS-CoV-2 и другие распространенные инфекционные агенты могут вызывать СД1.

Методика будет проверять, экспрессируют ли выздоравливающие пациенты, у которых развился СД1, преимущественно человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) HLA A*02 и HLA*24, путем окрашивания небольшой части образца антителами к этим HLA. Исследователи ожидают, что может произойти значительное обогащение HLA этих рисков заболеваний (>75% пациентов, экспрессирующих один из этих аллелей риска заболеваний) [2]. Библиотека Т-клеток [3] и мультимерный подход пептид-HLA [4-6] будут использоваться для выделения Т-клеток, которые распознают эпитопы SARS-CoV-2 и других распространенных патогенов через HLA A*02 и HLA*24. Созданные популяции моноклональных Т-клеток будут протестированы на распознавание известных диабетогенных эпитопов, присутствующих на поверхности бета-клеток поджелудочной железы человека. Если такая перекрестная реактивность Т-клеток будет выявлена ​​[7], команда секвенирует область, определяющую комплементарность родственного рецептора Т-клеток, чтобы ее можно было производить в виде растворимого белка [8] для дальнейших биофизических и структурных исследований [9, 10] направлены на понимание того, как SARS-CoV-2 и другие распространенные патогены могут вызывать СД1 у меньшинства людей.

Исследование будет проспективным, обсервационным. Участниками будут выздоравливающие пациенты с недавним новым диагнозом диабета 1 типа (n = 30). Подходящие участники будут определены и направлены консультирующими детскими эндокринологами Департамента здоровья детей в Совете здравоохранения Университета Квм Тафа Морганнуга, Департамента здоровья детей, Кардиффа и совета здравоохранения Вейла, а также Департамента здоровья детей, больницы Св. Марии, Лондон, который все они входят в состав группы клинических исследований и команды непосредственного клинического ухода. Все участники и их родители/опекуны получат информационный листок участника, и у них будет время и конфиденциальность, чтобы прочитать и понять его содержание. Член исследовательской группы, прошедший обучение надлежащей клинической практике, будет готов оказать поддержку и ответить на любые вопросы. Информированное согласие затем будет получено в письменной форме на форме согласия или, в случае педиатрических участников, на форме согласия и форме согласия родителя/опекуна. Участникам будет присвоен уникальный номер исследования.

Обученный флеботомист возьмет образец крови в объеме 50 мл (или меньше у детей в зависимости от веса участника). Образец будет анонимизирован и ему будет присвоен уникальный номер исследования. Нам потребуются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из крови в день набора. Обезличенные образцы крови будут переданы для исследования Т-клеток и в лабораторию Совета здравоохранения Университета Цвм Таф для серологических тестов (анализ Roche SARS-CoV-2 IgM и IgG в аккредитованной лаборатории UKAS) с соответствующей упаковкой UN3373. Образцы будут использоваться для иммунологических, вирусологических и генетических анализов хозяина. Кровь будет обработана для выделения сыворотки и РВМС, включая РНК и ДНК хозяина. Библиотеки Т-клеток будут созданы с использованием PBMC. Созданные клоны Т-клеток будут проверены на перекрестную реактивность с установленными диабетогенными эпитопами Т-клеток. Рецепторы Т-клеток (TCR) будут изготовлены из перекрестно-реактивных Т-клеток для дальнейшего изучения. Образцы РВМС также будут окрашены родственными мультимерами пептид-HLA с использованием проточной цитометрии. Это позволит получить информацию об их фенотипе и статусе активации.

Описание:

Кровь будет разделена на составные части с использованием раствора с густым градиентом плотности и центрифуги. Слой лейкоцитов, или РВМС, изолируется от других частей крови и сохраняется. Все остальные части выбрасываются в раствор отбеливателя. РВМС подвергаются дальнейшей обработке для выделения Т-клеток, которые затем могут пойти по одному из пяти путей:

1. Клетки обрабатывают для извлечения ДНК/РНК, а ДНК/РНК анализируют для получения информации о рецепторах Т-клеток и других связанных молекулах. Клетки погибают во время экстракции ДНК/РНК.
2. Клетки подвергнутся генетическому редактированию, чтобы получить информацию о процессах, участвующих в нормальной функции Т-клеток. Клетки будут культивироваться в течение 28 дней после редактирования генов, претерпят несколько раундов деления и станут нерелевантными с точки зрения закона Управления тканей человека (HTA) 2004 года.
3. Клетки будут использоваться в анализе, в котором они подвергаются воздействию перекрывающихся фрагментов белков SARS-CoV-2, затем их будут выращивать в культуре в течение 14 дней, после чего клетки подвергнутся делению и больше не будут иметь отношения к HTA. Клетки, реагирующие на белки SARS-CoV-2, будут проверены, чтобы выяснить, обладают ли они способностью разрушать бета-клетки поджелудочной железы, продуцирующие инсулин.
4. С помощью автоматического сортировщика и флуоресцентных маркеров клетки сортируются и анализируются. Клетки погибнут во время этого процесса, который происходит в день обработки клеток в лаборатории.
5. Клетки будут использоваться в анализах на планшетах, чтобы узнать о процессах, связанных с функциями Т-клеток. Клетки будут утилизированы после анализа, который может занять от 1 до 3 дней в зависимости от типа используемого анализа.

Эта методология была разработана после участия пациентов и общественности, которое проводилось удаленно из-за социального дистанцирования.