Karakterisering van de immuunrespons op SARS-CoV-2-infectie/COVID-19 bij diabetes type 1 (TIRID)

DOELSTELLINGEN EN DOELSTELLINGEN Het doel van dit project is om de immuunrespons van de gastheer op infectie met SARS-CoV-2 en andere veel voorkomende infecties in de loop van de tijd te begrijpen bij herstellende patiënten die diabetes type 1 (T1D) ontwikkelen. Voorlopige gegevens tonen aan dat diabetogene T-cellen bij patiënten die vóór 2019 T1D ontwikkelden, SARS-CoV-2 en andere veel voorkomende menselijke pathogenen kunnen herkennen. Als het omgekeerde waar is, zou dit een plausibel mechanisme bieden voor de ontwikkeling van T1D na SARS-CoV-2 of enkele veel voorkomende infecties. Wij willen graag weten waarom sommige mensen T1D ontwikkelen na infectie.

De primaire doelstellingen zijn om te bepalen of individuen die T1D ontwikkelen na infectie de HLA A*0201- en HLA*2402-genen dragen waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met T1D en om aan te tonen dat SARS-CoV-2/pathogeen-specifieke killer-T-cellen bij deze individuen in staat om insulineproducerende bètacellen van de alvleesklier direct te vernietigen. Het vermogen van pathogeenspecifieke T-cellen om diabetogene T-celepitopen te herkennen zal onderzocht worden met behulp van peptide-HLA-multimeren. Kruisreactieve T-celreceptoren zullen worden vervaardigd voor biofysische en structurele analyses om inzicht te krijgen in de manier waarop SARS-CoV-2 en andere veel voorkomende infectieuze agentia T1D kunnen veroorzaken.

De methodologie zal onderzoeken of herstellende patiënten die T1D ontwikkelen voornamelijk de menselijke leukocytantigenen (HLA's) HLA A*02 en HLA*24 tot expressie brengen door een klein deel van het monster te kleuren met antilichamen voor deze HLA. Onderzoekers verwachten dat er een grote verrijking zou kunnen zijn voor deze ziekterisico-HLA (>75% van de patiënten die een van deze ziekterisico-allelen tot expressie brengen) [2]. T-celbibliotheek [3] en peptide-HLA multimeer [4-6] benaderingen zullen worden gebruikt om T-cellen te isoleren die epitopen van SARS-CoV-2 en andere veel voorkomende pathogenen herkennen via HLA A*02 en HLA*24. De gegenereerde monoklonale T-celpopulaties zullen worden getest op herkenning van bekende diabetogene epitopen die aanwezig zijn op het oppervlak van bètacellen van de menselijke pancreas. Wanneer dergelijke kruisreactiviteit tussen T-cellen [7] wordt geïdentificeerd, zal het team het complementariteitsbepalende gebied van de verwante T-celreceptor sequencen, zodat het kan worden vervaardigd als een oplosbaar eiwit [8] voor verder biofysisch en structureel onderzoek [9, 10] gericht op het begrijpen hoe SARS-CoV-2 en andere veel voorkomende ziekteverwekkers T1D kunnen veroorzaken bij een minderheid van de individuen.

Het onderzoek zal een prospectief, observationeel onderzoek zijn. Deelnemers zijn herstellende patiënten met een recente nieuwe diagnose van diabetes type 1 (n=30). In aanmerking komende deelnemers worden geïdentificeerd en doorverwezen door consultant-pediatrische endocrinologen van het Department of Child Health van de Cwm Taf Morgannwg University Health Board, The Department of Child Health, Cardiff en de Vale Health Board en Department of Child Health, St, Mary's Hospital, Londen, die maken allemaal deel uit van het klinische onderzoeksstudieteam en het directe klinische zorgteam. Alle deelnemers en hun ouders/voogden ontvangen een deelnemersinformatieblad en hebben tijd en privacy om de inhoud te lezen en te begrijpen. Een lid van het onderzoeksteam dat is opgeleid in Good Clinical Practice zal beschikbaar zijn om ondersteuning te bieden en eventuele vragen te beantwoorden. Geïnformeerde toestemming wordt vervolgens schriftelijk verkregen op een toestemmingsformulier, of, in het geval van pediatrische deelnemers, op een toestemmingsformulier en een toestemmingsformulier voor ouders/voogd. Deelnemers krijgen een uniek studienummer.

Er wordt een bloedmonster afgenomen door een getrainde flebotomist, 50 ml (of minder bij kinderen, afhankelijk van het gewicht van de deelnemer). Het monster wordt geanonimiseerd en voorzien van het unieke studienummer. Op de dag van rekrutering hebben we perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) uit het bloed nodig. Geanonimiseerde bloedmonsters zullen worden overgedragen voor T-celonderzoek en het Cwm Taf University Health Board-laboratorium voor serologische tests (Roche SARS-CoV-2 IgM- en IgG-test in een door UKAS geaccrediteerd laboratorium) met de juiste UN3373-verpakking. Monsters zullen worden gebruikt voor immunologische, virologische en gastheergenetische testen. Het bloed zal worden verwerkt om serum en PBMC, inclusief gastheer-RNA en DNA, te isoleren. T-celbibliotheken zullen worden opgezet met behulp van de PBMC. De gegenereerde T-celklonen zullen worden getest op kruisreactiviteit met gevestigde diabetogene T-celepitopen. De T-celreceptoren (TCR's) zullen voor verder onderzoek worden vervaardigd uit kruisreactieve T-cellen. PBMC-monsters zullen ook worden gekleurd met verwante peptide-HLA-multimeren met behulp van flowcytometrie. Dit zal informatie genereren over hun fenotype en activeringsstatus.

Een lay-beschrijving:

Het bloed wordt in samenstellende delen gescheiden met behulp van een dikke dichtheidsgradiëntoplossing en een centrifuge. De witte bloedcellaag, of PBMC's, wordt geïsoleerd van andere delen van het bloed en vastgehouden. Alle andere delen worden weggegooid in een bleekoplossing. PBMC's worden verder verwerkt om de T-cellen te isoleren. Deze cellen kunnen vervolgens een van de volgende vijf routes volgen:

1. De cellen worden behandeld om het DNA/RNA te extraheren, en het DNA/RNA wordt geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de T-celreceptoren en andere geassocieerde moleculen. Tijdens de DNA/RNA-extractie worden de cellen gedood.
2. De cellen zullen genetische bewerking ondergaan om informatie te verschaffen over de processen die betrokken zijn bij de normale T-celfunctie. Cellen zullen gedurende 28 dagen na het bewerken van de genen worden gekweekt, zullen meerdere delingsrondes ondergaan en worden niet-relevant in de zin van de Human Tissue Authority (HTA) Act 2004.
3. De cellen zullen worden gebruikt in een test waarbij ze worden blootgesteld aan overlappende stukjes SARS-CoV-2-eiwitten. Ze zullen vervolgens gedurende 14 dagen in kweek worden gekweekt, waarna de cellen deling zullen hebben ondergaan en niet langer HTA-relevant zijn. Cellen die reageren op SARS-CoV-2-eiwitten zullen worden getest om te zien of ze het vermogen hebben om insulineproducerende bètacellen van de pancreas te vernietigen.
4. Met behulp van een geautomatiseerde sorteerder en fluorescerende markers worden de cellen gesorteerd en geanalyseerd. Tijdens dit proces, dat plaatsvindt op de dag dat de cellen in het laboratorium worden verwerkt, sterven cellen.
5. Cellen zullen worden gebruikt in plaatgebaseerde testen om meer te leren over de processen die betrokken zijn bij T-celfuncties. De cellen worden na de test verwijderd. Dit kan tussen 1 en 3 dagen duren, afhankelijk van het gebruikte type test.

Deze methodologie is ontworpen op basis van de betrokkenheid van patiënten en het publiek, die op afstand werden uitgevoerd vanwege sociale afstand.