Charakterystyka odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2/COVID-19 w cukrzycy typu 1 (TIRID)

CELE I ZADANIA Celem tego projektu jest poznanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie SARS-CoV-2 i inne częste infekcje u pacjentów w okresie rekonwalescencji, u których rozwinęła się cukrzyca typu 1 (T1D). Wstępne dane pokazują, że diabetogenne komórki T u pacjentów, u których rozwinęła się T1D przed 2019 rokiem, potrafią rozpoznawać SARS-CoV-2 i inne powszechne patogeny ludzkie. Jeśli sytuacja jest odwrotna, zapewniłoby to wiarygodny mechanizm rozwoju T1D w następstwie SARS-CoV-2 lub niektórych powszechnych infekcji. Chcielibyśmy ustalić, dlaczego u niektórych osób po zakażeniu rozwija się T1D.

Głównymi celami jest ustalenie, czy osoby, u których rozwinęła się T1D w wyniku zakażenia, noszą geny HLA A*0201 i HLA*2402, o których wiadomo, że są powiązane z T1D, oraz wykazanie, że limfocyty T zabójcze specyficzne dla SARS-CoV-2/patogenu u tych osób są zdolne do bezpośredniego niszczenia komórek beta trzustki wytwarzających insulinę. Zdolność limfocytów T specyficznych dla patogenu do rozpoznawania epitopów diabetogennych limfocytów T zostanie zbadana przy użyciu multimerów peptyd-HLA. Wyprodukowane zostaną krzyżowo reaktywne receptory komórek T do analiz biofizycznych i strukturalnych, aby umożliwić zrozumienie, w jaki sposób SARS-CoV-2 i inne powszechne czynniki zakaźne mogą wywoływać T1D.

Metodologia zbada, czy u rekonwalescencyjnych pacjentów, u których rozwinęła się T1D, następuje ekspresja ludzkich antygenów leukocytowych (HLA) HLA A*02 i HLA*24 poprzez barwienie małej części próbki przeciwciałami przeciwko tym HLA. Badacze przewidują, że może nastąpić duże wzbogacenie się w te HLA ryzyka choroby (> 75% pacjentów wykazujących ekspresję jednego z tych alleli ryzyka choroby) [2]. Do izolowania komórek T, które rozpoznają epitopy SARS-CoV-2 i innych powszechnych patogenów poprzez HLA A*02 i HLA*24, zostaną zastosowane podejścia oparte na bibliotece komórek T [3] i multimerze peptyd-HLA [4-6]. Wytworzone populacje monoklonalnych komórek T zostaną przetestowane pod kątem rozpoznawania znanych diabetogennych epitopów obecnych na powierzchni ludzkich komórek beta trzustki. W przypadku zidentyfikowania takiej reaktywności krzyżowej komórek T [7] zespół zsekwencjonuje region determinujący komplementarność pokrewnego receptora komórek T, tak aby można go było wytworzyć jako rozpuszczalne białko [8] do dalszych badań biofizycznych i strukturalnych [9, 10] miało na celu zrozumienie, w jaki sposób SARS-CoV-2 i inne powszechne patogeny mogą wywoływać T1D u mniejszości osób.

Badanie będzie miało charakter prospektywny i obserwacyjny. Uczestnikami będą pacjenci w okresie rekonwalescencji, z niedawno rozpoznaną cukrzycą typu 1 (n=30). Kwalifikujący się uczestnicy zostaną zidentyfikowani i skierowani przez konsultantów endokrynologów dziecięcych na Wydziale Zdrowia Dziecka w Radzie Zdrowia Uniwersytetu Cwm Taf Morgannwg, Wydziale Zdrowia Dziecka w Cardiff i Radzie Zdrowia Vale oraz Wydziale Zdrowia Dziecka w St. Mary's Hospital w Londynie, którzy wszyscy są częścią zespołu badawczego zajmującego się badaniami klinicznymi i zespołu bezpośredniej opieki klinicznej. Wszyscy uczestnicy i ich rodzice/opiekunowie otrzymają arkusz informacyjny dla uczestnika, dzięki czemu będą mieli czas i prywatność na przeczytanie i zrozumienie jego treści. Członek zespołu badawczego przeszkolony w zakresie Dobrej Praktyki Klinicznej będzie dostępny, aby zapewnić wsparcie i odpowiedzieć na wszelkie pytania. Świadoma zgoda zostanie następnie uzyskana w formie pisemnej na formularzu zgody lub, w przypadku uczestników pediatrycznych, na formularzu zgody i formularzu zgody rodzica/opiekuna. Uczestnicy otrzymają unikalny numer badania.

Przeszkolony flebotomista pobierze próbkę krwi o objętości 50 ml (lub mniej w przypadku dzieci, w zależności od wagi uczestnika). Próbka zostanie zanonimizowana i opatrzona unikalnym numerem badania. W dniu rekrutacji będziemy potrzebować komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Zanonimizowane próbki krwi zostaną przekazane do badań nad limfocytami T i do laboratorium komisji Cwm Taf University Health w celu wykonania testów serologicznych (test Roche SARS-CoV-2 IgM i IgG w laboratorium akredytowanym przez UKAS) z odpowiednim opakowaniem UN3373. Próbki zostaną wykorzystane do testów immunologicznych, wirusologicznych i genetycznych gospodarza. Krew zostanie przetworzona w celu wyizolowania surowicy i PBMC, w tym RNA i DNA gospodarza. Biblioteki komórek T zostaną utworzone przy użyciu PBMC. Wytworzone klony komórek T będą testowane pod kątem reaktywności krzyżowej z ustalonymi diabetogennymi epitopami komórek T. Receptory komórek T (TCR) będą wytwarzane z komórek T reagujących krzyżowo do dalszych badań. Próbki PBMC będą również barwione pokrewnymi multimerami peptyd-HLA przy użyciu cytometrii przepływowej. Spowoduje to wygenerowanie informacji o ich fenotypie i statusie aktywacji.

Opis świeckiego:

Krew zostanie rozdzielona na części składowe za pomocą roztworu o dużym gradiencie gęstości i wirówki. Warstwa białych krwinek (PBMC) jest izolowana od innych części krwi i zatrzymywana. Wszystkie pozostałe części odrzuca się w roztworze wybielacza. PBMC są dalej przetwarzane w celu wyizolowania komórek T. Komórki te mogą następnie przejść jedną z pięciu dróg:

1. Komórki poddaje się ekstrakcji DNA/RNA, które następnie analizuje się w celu uzyskania informacji o receptorach komórek T i innych powiązanych cząsteczkach. Komórki giną podczas ekstrakcji DNA/RNA.
2. Komórki zostaną poddane edycji genetycznej, aby dostarczyć informacji o procesach zachodzących w prawidłowym funkcjonowaniu komórek T. Komórki będą hodowane przez 28 dni po edycji genów, przejdą wiele rund podziału i staną się nieistotne w świetle ustawy Human Tissue Authority (HTA) z 2004 r.
3. Komórki zostaną wykorzystane w teście, w którym zostaną wystawione na działanie nakładających się fragmentów białek SARS-CoV-2, a następnie będą hodowane w hodowli przez 14 dni, po czym komórki ulegną podziałowi i nie będą już istotne dla HTA. Komórki reagujące na białka SARS-CoV-2 zostaną przetestowane, aby sprawdzić, czy mają zdolność niszczenia komórek beta trzustki wytwarzających insulinę.
4. Komórki są sortowane i analizowane za pomocą automatycznego sortownika i markerów fluorescencyjnych. Komórki umierają podczas tego procesu, który ma miejsce w dniu, w którym komórki są przetwarzane w laboratorium.
5. Komórki zostaną wykorzystane w testach płytkowych, aby poznać procesy związane z funkcjonowaniem komórek T. Komórki zostaną usunięte po teście, który może zająć od 1 do 3 dni, w zależności od rodzaju zastosowanego testu.

Metodologię tę opracowano w oparciu o zaangażowanie pacjentów i społeczeństwo, które przeprowadzono zdalnie ze względu na dystans społeczny.