Charakterizace imunitní odpovědi na infekci SARS-CoV-2 / COVID-19 u diabetu 1. typu (TIRID)

CÍLE A CÍLE Cílem tohoto projektu je porozumět imunitní reakci hostitele na infekci SARS-CoV-2 a další běžné infekce v průběhu času u pacientů v rekonvalescenci, u kterých se rozvine diabetes 1. typu (T1D). Předběžné údaje ukazují, že diabetogenní T-buňky u pacientů, u kterých se vyvinul T1D před rokem 2019, dokážou rozpoznat SARS-CoV-2 a další běžné lidské patogeny. Pokud je opak pravdou, poskytlo by to věrohodný mechanismus pro rozvoj T1D po SARS-CoV-2 nebo některých běžných infekcích. Rádi bychom zjistili, proč se u některých lidí po infekci rozvine T1D.

Primárním cílem je určit, zda jedinci, u kterých se po infekci rozvine T1D, nesou geny HLA A*0201 a HLA*2402, o kterých je známo, že jsou spojeny s T1D, a ukázat, že zabíječské T-buňky specifické pro SARS-CoV-2/patogen u těchto jedinců jsou schopné přímo ničit pankreatické beta buňky produkující inzulín. Schopnost patogen-specifických T-buněk rozpoznávat diabetogenní T-buněčné epitopy bude zkoumána pomocí peptid-HLA multimerů. Zkříženě reaktivní receptory T-buněk budou vyrobeny pro biofyzikální a strukturální analýzy, které umožní pochopit, jak SARS-CoV-2 a další běžná infekční agens mohou indukovat T1D.

Metodika bude zkoumat, zda rekonvalescentní pacienti, u kterých se rozvine T1D, exprimují převážně lidské leukocytární antigeny (HLA) HLA A*02 a HLA*24 barvením malé části vzorku protilátkami proti těmto HLA. Výzkumníci předpokládají, že by mohlo dojít k velkému obohacení těchto HLA s rizikem onemocnění (>75 % pacientů exprimujících jednu z těchto alel s rizikem onemocnění) [2]. K izolaci T-buněk, které rozpoznávají epitopy SARS-CoV-2 a dalších běžných patogenů prostřednictvím HLA A*02 a HLA*24, budou použity přístupy knihovny T-buněk [3] a peptid-HLA multimeru [4-6]. Vytvořené populace monoklonálních T-buněk budou testovány na rozpoznání známých diabetogenních epitopů přítomných na povrchu lidských pankreatických beta buněk. Tam, kde je taková zkřížená reaktivita T-buněk identifikována [7], bude tým sekvenovat oblast určující komplementaritu příbuzného receptoru T-buněk, aby mohl být vyroben jako rozpustný protein [8] pro další biofyzikální a strukturální studie [9, 10] zaměřené na pochopení toho, jak mohou SARS-CoV-2 a další běžné patogeny indukovat T1D u menšiny jedinců.

Studie bude prospektivní, observační. Účastníky budou pacienti v rekonvalescenci s nedávnou novou diagnózou diabetu 1. typu (n=30). Způsobilí účastníci budou identifikováni a doporučeni poradci dětských endokrinologů na Katedře dětského zdraví na Cwm Taf Morgannwg University Health board, The Department of Child Health, Cardiff and Vale Health Board a Department of Child Health, St, Mary's Hospital, London, kteří všichni jsou součástí klinického výzkumného studijního týmu a týmu přímé klinické péče. Všichni účastníci a jejich rodiče / opatrovníci obdrží informační list účastníka a budou mít čas a soukromí na přečtení a pochopení obsahu. Člen studijního týmu vyškolený v Správné klinické praxi bude k dispozici, aby poskytl podporu a odpověděl na jakékoli otázky. Informovaný souhlas pak bude získán písemně na formuláři souhlasu, nebo v případě pediatrických účastníků na formuláři souhlasu a na formuláři souhlasu rodiče/zákonného zástupce. Účastníkům bude přiděleno jedinečné studijní číslo.

Vzorek krve bude odebrán vyškoleným flebotomem, 50ml (u dětí i méně dle váhy účastníka). Vzorek bude anonymizován a bude mu přiděleno jedinečné číslo studie. Budeme vyžadovat mononukleární buňky periferní krve (PBMC) z krve v den náboru. Anonymizované vzorky krve budou převedeny pro výzkum T buněk a laboratoř Cwm Taf University Health pro sérologické testy (rozbor Roche SARS-CoV-2 IgM a IgG v laboratoři akreditované UKAS) s vhodným balením UN3373. Vzorky budou použity pro imunologické, virologické a hostitelské genetické testy. Krev bude zpracována k izolaci séra a PBMC, včetně hostitelské RNA a DNA. Knihovny T-buněk budou založeny pomocí PBMC. Vytvořené klony T-buněk budou testovány na zkříženou reaktivitu se zavedenými diabetogenními T-buněčnými epitopy. Receptory T-buněk (TCR) budou vyrobeny ze zkříženě reaktivních T-buněk pro další studium. Vzorky PBMC budou také obarveny příbuznými peptid-HLA multimery pomocí průtokové cytometrie. Tím se vygenerují informace o jejich fenotypu a stavu aktivace.

Laický popis:

Krev bude rozdělena na jednotlivé části pomocí roztoku s hustým gradientem hustoty a centrifugy. Vrstva bílých krvinek, neboli PBMC, je izolována z jiných částí krve a zachována. Všechny ostatní části se vyhodí do bělícího roztoku PBMC se dále zpracují, aby se izolovaly T-buňky, tyto buňky pak mohou jít jednou z pěti cest:

1. Buňky se zpracují, aby se extrahovala DNA/RNA, a DNA/RNA se analyzuje, aby se získaly informace o receptorech T-buněk a dalších přidružených molekulách. Buňky jsou usmrceny během extrakce DNA/RNA.
2. Buňky projdou genetickou úpravou, aby poskytly informace o procesech zapojených do normální funkce T-buněk. Buňky budou kultivovány po dobu 28 dnů po úpravě genu, projdou několika koly dělení a stanou se nerelevantními z hlediska zákona Human Tissue Authority (HTA) z roku 2004.
3. Buňky budou použity v testu, kde budou vystaveny překrývajícím se kouskům proteinů SARS-CoV-2, poté budou pěstovány v kultuře po dobu 14 dnů, po této době se buňky dělí a již nebudou HTA relevantní. Buňky, které reagují na proteiny SARS-CoV-2, budou testovány, aby se zjistilo, zda mají kapacitu zničit beta buňky pankreatu produkující inzulín.
4. Pomocí automatického třídiče a fluorescenčních markerů se buňky třídí a analyzují. Buňky během tohoto procesu, který se odehrává v den, kdy jsou buňky zpracovávány v laboratoři, zemřou.
5. Buňky budou použity v testech na destičkách, abychom se dozvěděli o procesech zahrnutých ve funkcích T-buněk. Buňky budou zlikvidovány po testu, který může trvat 1 až 3 dny v závislosti na typu použitého testu.

Tato metodika byla navržena v návaznosti na zapojení pacientů a veřejnosti, které byly prováděny na dálku kvůli sociálnímu distancování.