A SARS-CoV-2 fertőzésre / COVID-19-re adott immunválasz jellemzése 1-es típusú cukorbetegségben (TIRID)

CÉLKITŰZÉSEK A projekt célja a gazdaszervezet immunválaszának megértése a SARS-CoV-2-vel és más gyakori fertőzésekkel szemben idővel 1-es típusú cukorbetegségben (T1D) szenvedő lábadozó betegeknél. Az előzetes adatok azt mutatják, hogy azoknál a betegeknél, akiknél 2019 előtt alakult ki T1D, a diabetogén T-sejtek képesek felismerni a SARS-CoV-2-t és más gyakori humán kórokozókat. Ha a fordítottja igaz, ez elfogadható mechanizmust biztosítana a T1D kialakulásához SARS-CoV-2 vagy néhány gyakori fertőzés után. Szeretnénk megtudni, hogy egyeseknél miért alakul ki T1D fertőzés után.

Az elsődleges cél annak meghatározása, hogy a fertőzést követően T1D-t kifejlő egyedek hordozzák-e a HLA A*0201 és HLA*2402 géneket, amelyekről ismert, hogy kapcsolatban állnak a T1D-vel, és annak bemutatása, hogy ezekben az egyedekben a SARS-CoV-2/kórokozó-specifikus gyilkos T-sejtek képes közvetlenül elpusztítani a hasnyálmirigy inzulintermelő béta sejtjeit. A patogén-specifikus T-sejtek azon képességét, hogy felismerjék a diabetogén T-sejt-epitópokat, peptid-HLA multimerek segítségével vizsgáljuk. Keresztreaktív T-sejt-receptorokat gyártanak majd biofizikai és szerkezeti elemzésekhez, amelyek lehetővé teszik annak megértését, hogy a SARS-CoV-2 és más gyakori fertőző ágensek miként indukálhatják a T1D-t.

A módszertan azt vizsgálja, hogy a T1D-t kifejlődő lábadozó betegek túlnyomórészt a humán leukocita antigéneket (HLA-k) expresszálják-e a HLA A*02 és HLA*24, a minta egy kis részét ezen HLA-ellenes antitestekkel megfestve. A kutatók arra számítanak, hogy ezek a betegségkockázati HLA jelentős mértékben gazdagodhatnak (a betegek több mint 75%-a expresszál egy ilyen betegség kockázati allélt) [2]. A T-sejtkönyvtár [3] és a peptid-HLA multimer [4-6] megközelítéseket alkalmazzák olyan T-sejtek izolálására, amelyek felismerik a SARS-CoV-2 epitópjait és más gyakori kórokozókat a HLA A*02 és HLA*24 segítségével. A létrehozott monoklonális T-sejt-populációkat teszteljük a humán hasnyálmirigy béta-sejtek felszínén jelenlévő ismert diabetogén epitópok felismerésére. Ha ilyen T-sejt keresztreaktivitást [7] azonosítanak, a csapat megszekvenálja a rokon T-sejt receptor komplementaritást meghatározó régióját, hogy az oldható fehérjeként [8] előállítható legyen további biofizikai és szerkezeti vizsgálatokhoz [9, 10], amelynek célja annak megértése, hogy a SARS-CoV-2 és más gyakori kórokozók miként indukálhatják a T1D-t az egyének kisebbségében.

A vizsgálat prospektív, megfigyeléses vizsgálat lesz. A résztvevők olyan lábadozó betegek lesznek, akiknél a közelmúltban 1-es típusú cukorbetegséget diagnosztizáltak (n=30). A jogosult résztvevőket a Cwm Taf Morgannwg Egyetem Gyermekegészségügyi Tanszékének, a Cardiff és a Vale-i Egészségügyi Minisztérium Gyermekegészségügyi Tanszékének, valamint a londoni St, Mary's Hospital Gyermekegészségügyi Osztályának gyermek-endokrinológus szaktanácsadója azonosítja és utalja be. mind a klinikai kutatócsoport és a közvetlen klinikai gondozási csapat részei. Minden résztvevő és szüleik/gondviselőik kapnak egy résztvevői tájékoztatót, és lesz idejük és magánéletük a tartalom elolvasására és megértésére. A vizsgálati csoport jó klinikai gyakorlatra képzett tagja készséggel áll rendelkezésére, hogy támogatást nyújtson és válaszoljon a kérdésekre. A tájékozott beleegyezés ezután írásban, beleegyezési formanyomtatványon, illetve gyermekgyógyászati ​​résztvevők esetében hozzájárulási űrlapon és szülői/gondviselői beleegyezési űrlapon történik. A résztvevők egyedi tanulmányi számot kapnak.

Vérmintát vesz egy képzett phlebotomist, 50 ml-t (gyermekeknél a résztvevő súlyától függően kevesebbet). A mintát anonimizálják, és egyedi vizsgálati számmal látják el. A toborzás napján perifériás vér mononukleáris sejtekre (PBMC) lesz szükségünk a vérből. Az anonimizált vérmintákat megfelelő UN3373 csomagolással továbbítják a T-sejt-kutatáshoz és a Cwm Taf University Health Board laboratóriumához szerológiai tesztekhez (Roche SARS-CoV-2 IgM és IgG vizsgálat az UKAS által akkreditált laboratóriumban). A mintákat immunológiai, virológiai és gazdagenetikai vizsgálatokhoz használják fel. A vért feldolgozzák a szérum és a PBMC izolálására, beleértve a gazdaszervezet RNS-ét és DNS-ét. A T-sejt könyvtárakat a PBMC segítségével hozzuk létre. Az előállított T-sejt klónokat teszteljük a kialakult diabetogén T-sejt-epitópokkal való keresztreaktivitásra. A T-sejt receptorokat (TCR-eket) keresztreaktív T-sejtekből állítják elő további tanulmányozás céljából. A PBMC-mintákat rokon peptid-HLA multimerekkel is megfestjük áramlási citometria segítségével. Ez információkat generál a fenotípusukról és az aktiválási állapotukról.

A laikus leírása:

A vért sűrű sűrűséggradiens oldat és centrifuga segítségével részekre osztják. A fehérvérsejtréteget vagy a PBMC-ket a vér más részeitől izolálják és megtartják. Az összes többi alkatrészt fehérítőoldatban dobják el. A PBMC-ket tovább dolgozzák fel a T-sejtek izolálására, majd ezek a sejtek továbbhaladhatnak az öt út egyikén:

1. A sejteket kezelik, hogy kivonják a DNS-t/RNS-t, és a DNS-t/RNS-t elemzik, hogy információt szerezzenek a T-sejt-receptorokról és más kapcsolódó molekulákról. A sejtek elpusztulnak a DNS/RNS extrakció során.
2. A sejtek genetikai szerkesztésen esnek át, hogy információt adjanak a normál T-sejtek működésében részt vevő folyamatokról. A sejteket 28 napig tenyésztik a génszerkesztést követően, többszörös osztódáson mennek keresztül, és a Human Tissue Authority (HTA) 2004. évi törvénye értelmében nem lesz jelentősége.
3. A sejteket egy olyan vizsgálatban használjuk fel, ahol a SARS-CoV-2 fehérjék átfedő bitjeinek vannak kitéve, majd 14 napig tenyésztjük őket, ezután a sejtek osztódáson mennek keresztül, és már nem lesznek HTA-relevánsak. A SARS-CoV-2 fehérjékre reagáló sejteket tesztelni fogják, hogy megállapítsák, képesek-e elpusztítani az inzulintermelő hasnyálmirigy béta-sejteket.
4. Automatizált válogató és fluoreszcens markerek segítségével a sejteket szétválogatják és elemzik. A sejtek elpusztulnak a folyamat során, amely azon a napon megy végbe, amikor a sejteket feldolgozzák a laboratóriumban.
5. A sejteket lemezalapú vizsgálatokban használják majd fel, hogy megismerjék a T-sejtek működésében szerepet játszó folyamatokat. A sejteket az assay után ártalmatlanítják, ami 1-3 napig tarthat az alkalmazott vizsgálat típusától függően.

Ezt a módszertant a betegek és a nyilvánosság bevonása alapján alakították ki, amelyeket a társadalmi távolságtartás miatt távolról végeztek.