Charakterisierung der Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion / COVID-19 bei Typ-1-Diabetes (TIRID)

ZIELE UND ZIELE Ziel dieses Projekts ist es, die Immunantwort des Wirts auf eine Infektion mit SARS-CoV-2 und anderen häufigen Infektionen im Laufe der Zeit bei rekonvaleszenten Patienten zu verstehen, die Typ-1-Diabetes (T1D) entwickeln. Vorläufige Daten zeigen, dass diabetogene T-Zellen bei Patienten, die vor 2019 T1D entwickelten, SARS-CoV-2 und andere häufige menschliche Krankheitserreger erkennen können. Wenn das Gegenteil der Fall ist, wäre dies ein plausibler Mechanismus für die Entwicklung von T1D nach SARS-CoV-2 oder einigen häufigen Infektionen. Wir möchten herausfinden, warum manche Menschen nach einer Infektion T1D entwickeln.

Hauptziele sind die Feststellung, ob Personen, die nach einer Infektion T1D entwickeln, die HLA-Gene A*0201 und HLA*2402 tragen, von denen bekannt ist, dass sie mit T1D assoziiert sind, und der Nachweis, dass bei diesen Personen SARS-CoV-2/Erreger-spezifische Killer-T-Zellen vorhanden sind Es ist in der Lage, die insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse direkt zu zerstören. Mithilfe von Peptid-HLA-Multimeren soll die Fähigkeit erregerspezifischer T-Zellen untersucht werden, diabetogene T-Zell-Epitope zu erkennen. Für biophysikalische und strukturelle Analysen werden kreuzreaktive T-Zell-Rezeptoren hergestellt, um zu verstehen, wie SARS-CoV-2 und andere häufige Infektionserreger T1D auslösen könnten.

Die Methodik wird untersuchen, ob rekonvaleszente Patienten, die T1D entwickeln, überwiegend die menschlichen Leukozytenantigene (HLAs) HLA A*02 und HLA*24 exprimieren, indem ein kleiner Teil der Probe mit Antikörpern für diese HLA gefärbt wird. Die Forscher gehen davon aus, dass es zu einer starken Anreicherung dieser HLA mit Krankheitsrisiko kommen könnte (>75 % der Patienten exprimieren eines dieser Krankheitsrisiko-Allele) [2]. Mithilfe von T-Zellbibliotheken [3] und Peptid-HLA-Multimeren [4–6] werden T-Zellen isoliert, die Epitope von SARS-CoV-2 und anderen häufigen Krankheitserregern über HLA A*02 und HLA*24 erkennen. Die generierten monoklonalen T-Zellpopulationen werden auf die Erkennung bekannter diabetogener Epitope getestet, die auf der Oberfläche menschlicher Betazellen der Bauchspeicheldrüse vorhanden sind. Wenn eine solche T-Zell-Kreuzreaktivität [7] identifiziert wird, wird das Team die komplementaritätsbestimmende Region des verwandten T-Zell-Rezeptors sequenzieren, damit er als lösliches Protein [8] für weitere biophysikalische und strukturelle Studien hergestellt werden kann [9, 10] zielte darauf ab zu verstehen, wie SARS-CoV-2 und andere häufige Krankheitserreger bei einer Minderheit von Personen T1D auslösen könnten.

Bei der Studie handelt es sich um eine prospektive Beobachtungsstudie. Bei den Teilnehmern handelt es sich um rekonvaleszente Patienten mit neuer Typ-1-Diabetes-Diagnose (n=30). Berechtigte Teilnehmer werden von beratenden pädiatrischen Endokrinologen am Department of Child Health des Cwm Taf Morgannwg University Health Board, dem Department of Child Health, Cardiff und dem Vale Health Board sowie dem Department of Child Health, St, Mary's Hospital, London, identifiziert und überwiesen sind alle Teil des klinischen Forschungsstudienteams und des direkten klinischen Pflegeteams. Alle Teilnehmer und ihre Eltern/Erziehungsberechtigten erhalten ein Teilnehmerinformationsblatt und haben Zeit und Privatsphäre, den Inhalt zu lesen und zu verstehen. Ein in guter klinischer Praxis geschultes Mitglied des Studienteams steht Ihnen zur Unterstützung und Beantwortung Ihrer Fragen zur Verfügung. Die Einverständniserklärung wird dann schriftlich auf einem Einverständnisformular oder bei pädiatrischen Teilnehmern auf einem Einverständnisformular und einem Einverständnisformular der Eltern/Erziehungsberechtigten eingeholt. Den Teilnehmern wird eine eindeutige Studiennummer zugeteilt.

Von einem ausgebildeten Phlebotomiker wird eine Blutprobe entnommen, 50 ml (oder weniger bei Kindern, je nach Gewicht des Teilnehmers). Die Probe wird anonymisiert und mit der eindeutigen Studiennummer versehen. Wir benötigen am Tag der Rekrutierung mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC). Anonymisierte Blutproben werden für die T-Zell-Forschung und das Labor des Cwm Taf University Health Board für serologische Tests (Roche SARS-CoV-2 IgM- und IgG-Assay in einem UKAS-akkreditierten Labor) mit entsprechender UN3373-Verpackung übertragen. Die Proben werden für immunologische, virologische und wirtsgenetische Tests verwendet. Das Blut wird verarbeitet, um Serum und PBMC, einschließlich Wirts-RNA und -DNA, zu isolieren. Mithilfe der PBMC werden T-Zellbibliotheken aufgebaut. Die erzeugten T-Zell-Klone werden auf Kreuzreaktivität mit etablierten diabetogenen T-Zell-Epitopen getestet. Die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) werden für weitere Untersuchungen aus kreuzreaktiven T-Zellen hergestellt. PBMC-Proben werden auch mittels Durchflusszytometrie mit verwandten Peptid-HLA-Multimeren gefärbt. Dadurch werden Informationen über ihren Phänotyp und ihren Aktivierungsstatus generiert.

Eine Laienbeschreibung:

Das Blut wird mithilfe einer dicken Dichtegradientenlösung und einer Zentrifuge in seine Bestandteile getrennt. Die weiße Blutkörperchenschicht oder PBMCs wird von anderen Teilen des Blutes isoliert und zurückgehalten. Alle anderen Teile werden in einer Bleichlösung entsorgt. PBMCs werden weiterverarbeitet, um die T-Zellen zu isolieren. Diese Zellen können dann einen von fünf Wegen einschlagen:

1. Die Zellen werden behandelt, um die DNA/RNA zu extrahieren, und die DNA/RNA wird analysiert, um Informationen über die T-Zell-Rezeptoren und andere assoziierte Moleküle zu gewinnen. Bei der DNA/RNA-Extraktion werden die Zellen abgetötet.
2. Die Zellen werden einer genetischen Bearbeitung unterzogen, um Informationen über die Prozesse zu liefern, die an der normalen T-Zell-Funktion beteiligt sind. Zellen werden nach der Genbearbeitung 28 Tage lang kultiviert, durchlaufen mehrere Teilungsrunden und verlieren im Sinne des Human Tissue Authority (HTA) Act 2004 ihre Relevanz.
3. Die Zellen werden in einem Test verwendet, bei dem sie überlappenden Teilen von SARS-CoV-2-Proteinen ausgesetzt werden. Anschließend werden sie 14 Tage lang in Kultur gezüchtet. Danach haben die Zellen eine Teilung durchlaufen und sind nicht mehr HTA-relevant. Zellen, die auf SARS-CoV-2-Proteine ​​reagieren, werden getestet, um festzustellen, ob sie in der Lage sind, insulinproduzierende Betazellen der Bauchspeicheldrüse zu zerstören.
4. Mithilfe eines automatischen Sortierers und fluoreszierender Marker werden die Zellen sortiert und analysiert. Während dieses Prozesses, der an dem Tag stattfindet, an dem die Zellen im Labor verarbeitet werden, sterben Zellen ab.
5. Zellen werden in plattenbasierten Tests verwendet, um mehr über die Prozesse zu erfahren, die an der T-Zell-Funktion beteiligt sind. Die Zellen werden nach dem Test entsorgt, was je nach Art des verwendeten Tests zwischen 1 und 3 Tagen dauern kann.

Diese Methodik wurde im Anschluss an die Patienten- und Öffentlichkeitsbeteiligung entwickelt, die aufgrund der sozialen Distanzierung aus der Ferne durchgeführt wurden.