Karakterisering av immunsvaret mot SARS-CoV-2-infektion/covid-19 vid typ 1-diabetes (TIRID)

MÅL OCH MÅL Målet med detta projekt är att förstå värdens immunsvar mot infektion med SARS-CoV-2 och andra vanliga infektioner över tid hos konvalescenta patienter som utvecklar typ 1-diabetes (T1D). Preliminära data visar att diabetogena T-celler hos patienter som utvecklade T1D före 2019 kan känna igen SARS-CoV-2 och andra vanliga mänskliga patogener. Om det omvända är sant, skulle det ge en rimlig mekanism för utvecklingen av T1D efter SARS-CoV-2 eller några vanliga infektioner. Vi skulle vilja ta reda på varför vissa människor utvecklar T1D efter infektion.

Primära mål är att fastställa om individer som utvecklar T1D efter infektion bär HLA A*0201- och HLA*2402-gener som är kända för att vara associerade med T1D och att visa att SARS-CoV-2/patogenspecifika mördar-T-celler hos dessa individer är kan direkt förstöra insulinproducerande betaceller från bukspottkörteln. Förmågan hos patogenspecifika T-celler att känna igen diabetogena T-cellsepitoper kommer att undersökas med användning av peptid-HLA-multimerer. Korsreaktiva T-cellsreceptorer kommer att tillverkas för biofysikaliska och strukturella analyser för att möjliggöra en förståelse för hur SARS-CoV-2 och andra vanliga smittämnen kan inducera T1D.

Metoden kommer att undersöka om konvalescenta patienter som utvecklar T1D övervägande uttrycker de humana leukocytantigenerna (HLA) HLA A*02 och HLA*24 genom att färga en liten del av provet med antikroppar mot dessa HLA. Utredarna förutser att det kan finnas en stor anrikning för dessa sjukdomsrisk-HLA (>75 % av patienterna som uttrycker en av dessa sjukdomsriskalleler) [2]. T-cellsbibliotek [3] och peptid-HLA multimer [4-6] tillvägagångssätt kommer att användas för att isolera T-celler som känner igen epitoper från SARS-CoV-2 och andra vanliga patogener via HLA A*02 och HLA*24. De monoklonala T-cellspopulationerna som genereras kommer att testas för igenkänning av kända diabetogena epitoper som finns på ytan av humana pankreatiska betaceller. När sådan T-cells korsreaktivitet [7] identifieras kommer teamet att sekvensera den komplementaritetsbestämmande regionen av den besläktade T-cellsreceptorn så att den kan tillverkas som ett lösligt protein [8] för ytterligare biofysikaliska och strukturella studier [9, 10] som syftar till att förstå hur SARS-CoV-2 och andra vanliga patogener kan inducera T1D hos en minoritet av individer.

Studien kommer att vara en prospektiv, observationsstudie. Deltagarna kommer att vara konvalescenta patienter med nydiagnos typ 1-diabetes (n=30). Kvalificerade deltagare kommer att identifieras och hänvisas från konsulterande pediatriska endokrinologer vid Department of Child Health vid Cwm Taf Morgannwg University Health Board, The Department of Child Health, Cardiff och Vale Health Board och Department of Child Health, St, Mary's Hospital, London som är alla en del av det kliniska forskningsteamet och det direkta kliniska vårdteamet. Alla deltagare och deras föräldrar/vårdnadshavare får ett deltagarinformationsblad och har tid och integritet att läsa och förstå innehållet. En medlem av studieteamet utbildad i god klinisk praxis kommer att vara tillgänglig för att ge stöd och svara på eventuella frågor. Informerat samtycke inhämtas sedan skriftligt på en samtyckesblankett, eller för pediatriska deltagare på en samtyckesblankett och en förälders/vårdnadshavares samtyckesblankett. Deltagarna kommer att tilldelas ett unikt studienummer.

Ett blodprov kommer att tas av en utbildad flebotomist, 50 ml (eller mindre hos barn beroende på deltagarens vikt). Provet kommer att anonymiseras och ges det unika studienumret. Vi kommer att kräva perifera mononukleära blodceller (PBMC) från blod på rekryteringsdagen. Anonymiserade blodprover kommer att överföras till T-cellsforskning och Cwm Taf University Health Board laboratorium för serologiska tester (Roche SARS-CoV-2 IgM och IgG-analys vid ett UKAS-ackrediterat laboratorium) med lämplig UN3373-förpackning. Prover kommer att användas för immunologiska, virologiska och värdgenetiska analyser. Blod kommer att behandlas för att isolera serum och PBMC, inklusive värd-RNA och DNA. T-cellsbibliotek kommer att etableras med hjälp av PBMC. T-cellkloner som genereras kommer att testas för korsreaktivitet med etablerade diabetogena T-cellsepitoper. T-cellsreceptorerna (TCR) kommer att tillverkas av korsreaktiva T-celler för vidare studier. PBMC-prover kommer också att färgas med besläktade peptid-HLA-multimerer med hjälp av flödescytometri. Detta kommer att generera information om deras fenotyp och aktiveringsstatus.

En lay-beskrivning:

Blodet kommer att separeras i beståndsdelar med hjälp av en tjock densitetsgradientlösning och en centrifug. Det vita blodkroppslagret, eller PBMCs, isoleras från andra delar av blodet och behålls. Alla andra delar kasseras i en bleklösning PBMC bearbetas vidare för att isolera T-cellerna, dessa celler kan sedan gå ner på en av fem vägar:

1. Cellerna behandlas för att extrahera DNA/RNA, och DNA/RNA analyseras för att få information om T-cellsreceptorerna och andra associerade molekyler. Cellerna dödas under DNA/RNA-extraktion.
2. Cellerna kommer att genomgå genetisk redigering för att ge information om de processer som är involverade i normal T-cellsfunktion. Celler kommer att odlas i 28 dagar efter genredigering, kommer att genomgå flera delningsomgångar och blir icke-relevanta i termer av Human Tissue Authority (HTA) Act 2004.
3. Cellerna kommer att användas i en analys där de utsätts för överlappande bitar av SARS-CoV-2-proteiner, de kommer sedan att odlas i odling i 14 dagar, varefter cellerna kommer att ha genomgått delning och inte längre är HTA-relevanta. Celler som svarar på SARS-CoV-2-proteiner kommer att testas för att se om de har kapacitet att förstöra insulinproducerande betaceller från bukspottkörteln.
4. Med hjälp av en automatiserad sorterare och fluorescerande markörer sorteras och analyseras cellerna. Celler kommer att dö under denna process som äger rum samma dag som celler bearbetas i labbet.
5. Celler kommer att användas i plattbaserade analyser för att lära sig om de processer som är involverade i T-cellsfunktioner. Celler kommer att kasseras efter analysen, vilket kan ta mellan 1 och 3 dagar beroende på vilken typ av analys som används.

Denna metod utformades efter Patient och allmänhetens deltagande, som genomfördes på distans på grund av social distansering.