Karakterisering av immunresponsen på SARS-CoV-2-infeksjon / COVID-19 ved type 1-diabetes (TIRID)

MÅL OG MÅL Målet med dette prosjektet er å forstå vertens immunrespons på infeksjon med SARS-CoV-2 og andre vanlige infeksjoner over tid hos rekonvalesent pasienter som utvikler type 1 diabetes (T1D). Foreløpige data viser at diabetogene T-celler hos pasienter som utviklet T1D før 2019 kan gjenkjenne SARS-CoV-2 og andre vanlige menneskelige patogener. Hvis det motsatte er sant, vil det gi en plausibel mekanisme for utvikling av T1D etter SARS-CoV-2 eller noen vanlige infeksjoner. Vi ønsker å finne ut hvorfor noen mennesker utvikler T1D etter infeksjon.

Primære mål er å finne ut om individer som utvikler T1D etter infeksjon bærer HLA A*0201- og HLA*2402-genene som er kjent for å være assosiert med T1D, og ​​å vise at SARS-CoV-2/patogenspesifikke morder-T-celler hos disse individene er i stand til direkte å ødelegge insulinproduserende betaceller i bukspyttkjertelen. Evnen til patogenspesifikke T-celler til å gjenkjenne diabetogene T-celleepitoper vil bli undersøkt ved bruk av peptid-HLA multimerer. Kryssreaktive T-cellereseptorer vil bli produsert for biofysiske og strukturelle analyser for å muliggjøre en forståelse av hvordan SARS-CoV-2 og andre vanlige smittestoffer kan indusere T1D.

Metodikk vil undersøke om rekonvalesenspasienter som utvikler T1D hovedsakelig uttrykker de humane leukocyttantigener (HLAs) HLA A*02 og HLA*24 ved å farge en liten del av prøven med antistoffer for disse HLA. Etterforskere forventer at det kan være en stor berikelse for disse sykdomsrisiko-HLA (>75 % av pasientene som uttrykker en av disse sykdomsrisiko-allelene) [2]. T-cellebibliotek [3] og peptid-HLA multimer [4-6] tilnærminger vil bli brukt for å isolere T-celler som gjenkjenner epitoper fra SARS-CoV-2 og andre vanlige patogener via HLA A*02 og HLA*24. De genererte monoklonale T-cellepopulasjonene vil bli testet for gjenkjennelse av kjente diabetogene epitoper som er tilstede på overflaten av humane betaceller fra bukspyttkjertelen. Der slik T-celle kryssreaktivitet [7] er identifisert, vil teamet sekvensere den komplementaritetsbestemmende regionen til den beslektede T-cellereseptoren slik at den kan produseres som et løselig protein [8] for videre biofysiske og strukturelle studier [9, 10] rettet mot å forstå hvordan SARS-CoV-2 og andre vanlige patogener kan indusere T1D hos et mindretall av individer.

Studien vil være prospektiv, observasjonsstudie. Deltakerne vil være rekonvalesent pasienter med nylig diagnostisert type 1 diabetes (n=30). Kvalifiserte deltakere vil bli identifisert og henvist fra konsulent pediatriske endokrinologer ved The Department of Child Health ved Cwm Taf Morgannwg University Health Board, The Department of Child Health, Cardiff and the Vale Health Board og Department of Child Health, St, Mary's Hospital, London som er alle en del av det kliniske forskningsteamet og det direkte kliniske omsorgsteamet. Alle deltakere og deres foreldre/foresatte vil motta et deltakerinformasjonsark og ha tid og privatliv til å lese og forstå innholdet. Et medlem av studieteamet opplært i god klinisk praksis vil være tilgjengelig for å gi støtte og svare på eventuelle spørsmål. Informert samtykke vil da innhentes skriftlig på et samtykkeskjema, eller ved pediatriske deltakere på et samtykkeskjema og et samtykkeskjema for foreldre/foresatte. Deltakerne vil få et unikt studienummer.

En blodprøve vil bli tatt av en utdannet phlebotomist, 50 ml (eller mindre hos barn i henhold til deltakerens vekt). Prøven vil bli anonymisert og utstedt med det unike studienummeret. Vi vil kreve perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra blod på rekrutteringsdagen. Anonymiserte blodprøver vil bli overført til T-celleforskning og Cwm Taf University Health Board laboratorium for serologitester (Roche SARS-CoV-2 IgM og IgG-analyse ved et UKAS-akkreditert laboratorium) med passende UN3373-emballasje. Prøver vil bli brukt til immunologiske, virologiske og vertsgenetiske analyser. Blod vil bli behandlet for å isolere serum og PBMC, inkludert verts-RNA og DNA. T-cellebiblioteker vil bli etablert ved hjelp av PBMC. T-cellekloner generert vil bli testet for kryssreaktivitet med etablerte diabetogene T-celleepitoper. T-cellereseptorene (TCRs) vil bli produsert fra kryssreaktive T-celler for videre studier. PBMC-prøver vil også bli farget med beslektede peptid-HLA-multimerer ved bruk av flowcytometri. Dette vil generere informasjon om deres fenotype og aktiveringsstatus.

En lay-beskrivelse:

Blodet vil bli separert i bestanddeler ved hjelp av en tykk tetthetsgradientløsning og en sentrifuge. Det hvite blodcellelaget, eller PBMC-er, isoleres fra andre deler av blodet og beholdes. Alle andre deler kastes i en blekeløsning. PBMC-er behandles videre for å isolere T-cellene, disse cellene kan deretter gå ned en av fem ruter:

1. Cellene behandles for å trekke ut DNA/RNA, og DNA/RNA analyseres for å få informasjon om T-cellereseptorene og andre assosierte molekyler. Cellene blir drept under DNA/RNA-ekstraksjon.
2. Cellene vil gjennomgå genetisk redigering for å gi informasjon om prosessene involvert i normal T-cellefunksjon. Celler vil bli dyrket i 28 dager etter genredigering, vil gjennomgå flere delingsrunder og bli ikke-relevante i forhold til Human Tissue Authority (HTA) Act 2004.
3. Cellene skal brukes i en analyse hvor de eksponeres for overlappende biter av SARS-CoV-2-proteiner, de vil deretter dyrkes i kultur i 14 dager, hvoretter cellene vil ha gjennomgått deling og vil ikke lenger være HTA-relevante. Celler som reagerer på SARS-CoV-2-proteiner vil bli testet for å se om de har kapasitet til å ødelegge insulinproduserende betaceller fra bukspyttkjertelen.
4. Ved hjelp av en automatisert sorterer og fluorescerende markører blir cellene sortert og analysert. Celler vil dø under denne prosessen som finner sted den dagen cellene behandles i laboratoriet.
5. Celler vil bli brukt i platebaserte analyser for å lære om prosessene involvert i T-cellefunksjoner. Celler vil bli kastet etter analysen som kan ta mellom 1 og 3 dager avhengig av type analyse som brukes.

Denne metodikken ble designet etter pasient- og offentlig involvering, som ble utført eksternt på grunn av sosial distansering.