Caracterización de la respuesta inmune a la infección por SARS-CoV-2 / COVID-19 en diabetes tipo 1 (TIRID)

FINALIDADES Y OBJETIVOS El objetivo de este proyecto es comprender la respuesta inmune del huésped a la infección por SARS-CoV-2 y otras infecciones comunes a lo largo del tiempo en pacientes convalecientes que desarrollan diabetes tipo 1 (DT1). Los datos preliminares muestran que las células T diabetogénicas en pacientes que desarrollaron diabetes Tipo 1 antes de 2019 pueden reconocer el SARS-CoV-2 y otros patógenos humanos comunes. Si ocurre lo contrario, proporcionaría un mecanismo plausible para el desarrollo de diabetes tipo 1 después del SARS-CoV-2 o algunas infecciones comunes. Nos gustaría determinar por qué algunas personas desarrollan diabetes tipo 1 después de la infección.

Los objetivos principales son determinar si las personas que desarrollan diabetes tipo 1 después de una infección portan los genes HLA A*0201 y HLA*2402 que se sabe están asociados con la diabetes tipo 1 y mostrar que las células T asesinas específicas del patógeno/SARS-CoV-2 en estos individuos son capaz de destruir directamente las células beta pancreáticas productoras de insulina. La capacidad de las células T específicas de patógenos para reconocer epítopos de células T diabetogénicas se examinará utilizando multímeros de péptido-HLA. Se fabricarán receptores de células T con reacción cruzada para análisis biofísicos y estructurales que permitan comprender cómo el SARS-CoV-2 y otros agentes infecciosos comunes podrían inducir la diabetes tipo 1.

La metodología examinará si los pacientes convalecientes que desarrollan diabetes tipo 1 expresan predominantemente los antígenos leucocitarios humanos (HLA) HLA A*02 y HLA*24 tiñendo una pequeña parte de la muestra con anticuerpos para estos HLA. Los investigadores anticipan que podría haber un gran enriquecimiento de estos HLA de riesgo de enfermedad (>75% de los pacientes que expresan uno de estos alelos de riesgo de enfermedad) [2]. Se utilizarán enfoques de biblioteca de células T [3] y multímero de péptido-HLA [4-6] para aislar células T que reconocen epítopos del SARS-CoV-2 y otros patógenos comunes a través de HLA A*02 y HLA*24. Las poblaciones de células T monoclonales generadas se probarán para reconocer epítopos diabetogénicos conocidos presentes en la superficie de las células beta pancreáticas humanas. Cuando se identifique dicha reactividad cruzada de células T [7], el equipo secuenciará la región determinante de la complementariedad del receptor de células T afín para que pueda fabricarse como una proteína soluble [8] para estudios biofísicos y estructurales adicionales [9, 10] tenía como objetivo comprender cómo el SARS-CoV-2 y otros patógenos comunes podrían inducir diabetes tipo 1 en una minoría de personas.

El estudio será un estudio observacional prospectivo. Los participantes serán pacientes convalecientes con un nuevo diagnóstico reciente de diabetes tipo 1 (n = 30). Los participantes elegibles serán identificados y remitidos por endocrinólogos pediátricos consultores del Departamento de Salud Infantil de la junta de salud de la Universidad Cwm Taf Morgannwg, el Departamento de Salud Infantil de Cardiff y la junta de salud de Vale y el Departamento de Salud Infantil del St. Mary's Hospital de Londres, quienes Todos son parte del equipo de estudio de investigación clínica y del equipo de atención clínica directa. Todos los participantes y sus padres/tutores recibirán una hoja de información del participante y tendrán tiempo y privacidad para leer y comprender el contenido. Un miembro del equipo del estudio capacitado en Buenas Prácticas Clínicas estará disponible para brindar apoyo y responder cualquier pregunta. Luego, el consentimiento informado se obtendrá por escrito en un formulario de consentimiento o, en el caso de participantes pediátricos, en un formulario de consentimiento y un formulario de consentimiento del padre/tutor. Los participantes recibirán un número de estudio único.

Un flebotomista capacitado tomará una muestra de sangre, 50 ml (o menos en niños según el peso del participante). La muestra será anónima y se le asignará el número de estudio único. Necesitaremos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre el día del reclutamiento. Se transferirán muestras de sangre anónimas para la investigación de células T y al laboratorio de la junta de salud de la Universidad Cwm Taf para pruebas serológicas (ensayo Roche SARS-CoV-2 IgM e IgG en un laboratorio acreditado por UKAS) con el embalaje UN3373 adecuado. Las muestras se utilizarán para ensayos inmunológicos, virológicos y genéticos del huésped. La sangre se procesará para aislar suero y PBMC, incluido el ARN y el ADN del huésped. Las bibliotecas de células T se establecerán utilizando PBMC. Los clones de células T generados se analizarán para determinar su reactividad cruzada con epítopos de células T diabetogénicos establecidos. Los receptores de células T (TCR) se fabricarán a partir de células T con reacción cruzada para su posterior estudio. Las muestras de PBMC también se teñirán con multímeros de péptido-HLA afines mediante citometría de flujo. Esto generará información sobre su fenotipo y estado de activación.

Una descripción laica:

La sangre se separará en sus partes constituyentes utilizando una solución espesa de gradiente de densidad y una centrífuga. La capa de glóbulos blancos, o PBMC, se aísla de otras partes de la sangre y se retiene. Todas las demás partes se descartan en una solución de lejía. Las PBMC se procesan adicionalmente para aislar las células T; estas células luego pueden seguir una de cinco rutas:

1. Las células se tratan para extraer el ADN/ARN, y el ADN/ARN se analiza para obtener información sobre los receptores de las células T y otras moléculas asociadas. Las células mueren durante la extracción de ADN/ARN.
2. Las células se someterán a edición genética para proporcionar información sobre los procesos implicados en la función normal de las células T. Las células se cultivarán durante 28 días después de la edición genética, se someterán a múltiples rondas de división y dejarán de ser relevantes en términos de la ley de la Autoridad de Tejidos Humanos (HTA) de 2004.
3. Las células se utilizarán en un ensayo en el que se exponen a fragmentos superpuestos de proteínas del SARS-CoV-2, luego se cultivarán durante 14 días, después de lo cual las células se habrán dividido y ya no serán relevantes para la HTA. Se probarán las células que responden a las proteínas del SARS-CoV-2 para ver si tienen capacidad para destruir las células beta pancreáticas productoras de insulina.
4. Utilizando un clasificador automatizado y marcadores fluorescentes, las células se clasifican y analizan. Las células morirán durante este proceso que tiene lugar el día en que se procesan en el laboratorio.
5. Las células se utilizarán en ensayos en placas para conocer los procesos implicados en las funciones de las células T. Las células se eliminarán después del ensayo, lo que puede tardar entre 1 y 3 días, según el tipo de ensayo utilizado.

Esta metodología fue diseñada siguiendo la Participación del Paciente y el Público, las cuales se llevaron a cabo de forma remota debido al distanciamiento social.