Caracterização da Resposta Imune à Infecção por SARS-CoV-2/COVID-19 na Diabetes Tipo 1 (TIRID)

METAS E OBJETIVOS O objetivo deste projeto é compreender a resposta imunológica do hospedeiro à infecção por SARS-CoV-2 e outras infecções comuns ao longo do tempo em pacientes convalescentes que desenvolvem diabetes tipo 1 (DT1). Dados preliminares mostram que as células T diabetogênicas em pacientes que desenvolveram DM1 antes de 2019 podem reconhecer o SARS-CoV-2 e outros patógenos humanos comuns. Se o inverso for verdadeiro, forneceria um mecanismo plausível para o desenvolvimento de DM1 após SARS-CoV-2 ou algumas infecções comuns. Gostaríamos de saber por que algumas pessoas desenvolvem DM1 após a infecção.

Os objetivos primários são determinar se os indivíduos que desenvolvem DM1 após a infecção possuem os genes HLA A*0201 e HLA*2402 conhecidos por estarem associados ao DM1 e mostrar que SARS-CoV-2/células T assassinas específicas de patógenos nesses indivíduos são capaz de destruir diretamente as células beta pancreáticas produtoras de insulina. A capacidade das células T específicas do patógeno de reconhecer epítopos de células T diabetogênicas será examinada usando multímeros de peptídeo-HLA. Os receptores de células T com reatividade cruzada serão fabricados para análises biofísicas e estruturais para permitir uma compreensão de como o SARS-CoV-2 e outros agentes infecciosos comuns podem induzir o DM1.

A metodologia examinará se os pacientes convalescentes que desenvolvem DM1 expressam predominantemente os antígenos leucocitários humanos (HLAs) HLA A*02 e HLA*24, colorindo uma pequena parte da amostra com anticorpos para esses HLA. Os investigadores antecipam que poderia haver um grande enriquecimento para esses HLA de risco de doença (> 75% dos pacientes que expressam um desses alelos de risco de doença) [2]. As abordagens de biblioteca de células T [3] e multímero de peptídeo-HLA [4-6] serão usadas para isolar células T que reconhecem epítopos de SARS-CoV-2 e outros patógenos comuns via HLA A*02 e HLA*24. As populações monoclonais de células T geradas serão testadas quanto ao reconhecimento de epítopos diabetogênicos conhecidos presentes na superfície das células beta pancreáticas humanas. Onde tal reatividade cruzada de células T [7] for identificada, a equipe sequenciará a região determinante de complementaridade do receptor de células T cognato para que possa ser fabricada como uma proteína solúvel [8] para estudos biofísicos e estruturais adicionais [9, 10] teve como objetivo compreender como o SARS-CoV-2 e outros patógenos comuns podem induzir DM1 em uma minoria de indivíduos.

O estudo será um estudo prospectivo e observacional. Os participantes serão pacientes convalescentes com novo diagnóstico recente de diabetes tipo 1 (n=30). Os participantes elegíveis serão identificados e encaminhados por Endocrinologistas Pediátricos Consultores do Departamento de Saúde Infantil do Conselho de Saúde da Universidade Cwm Taf Morgannwg, do Departamento de Saúde Infantil, Cardiff e do conselho de saúde da Vale e do Departamento de Saúde Infantil, St, Mary's Hospital, Londres que todos fazem parte da equipe de estudo de pesquisa clínica e da equipe de atendimento clínico direto. Todos os participantes e seus pais/responsáveis ​​receberão uma ficha de informações do participante e terão tempo e privacidade para ler e compreender o conteúdo. Um membro da equipe do estudo treinado em Boas Práticas Clínicas estará disponível para fornecer suporte e esclarecer quaisquer dúvidas. O consentimento informado será então obtido por escrito em um formulário de consentimento ou, no caso de participantes pediátricos, em um formulário de consentimento e um formulário de consentimento dos pais/responsáveis. Os participantes receberão um número de estudo exclusivo.

Uma amostra de sangue será coletada por um flebotomista treinado, 50mls (ou menos em crianças de acordo com o peso do participante). A amostra será anonimizada e emitida com o número exclusivo do estudo. Exigiremos células mononucleares do sangue periférico (PBMC) do sangue no dia do recrutamento. Amostras de sangue anonimizadas serão transferidas para pesquisa de células T e laboratório do conselho de saúde da Cwm Taf University para testes sorológicos (ensaio Roche SARS-CoV-2 IgM e IgG em um laboratório credenciado pelo UKAS) com embalagem UN3373 apropriada. As amostras serão utilizadas para ensaios imunológicos, virológicos e genéticos do hospedeiro. Os sangues serão processados ​​para isolar soro e PBMC, incluindo RNA e DNA do hospedeiro. Bibliotecas de células T serão estabelecidas usando o PBMC. Os clones de células T gerados serão testados quanto à reatividade cruzada com epítopos de células T diabetogênicos estabelecidos. Os receptores de células T (TCRs) serão fabricados a partir de células T com reação cruzada para estudos adicionais. Amostras de PBMC também serão coradas com multímeros de peptídeo-HLA cognatos usando citometria de fluxo. Isto irá gerar informações sobre seu fenótipo e status de ativação.

Uma descrição leiga:

O sangue será separado em partes constituintes usando uma solução espessa de gradiente de densidade e uma centrífuga. A camada de glóbulos brancos, ou PBMCs, é isolada de outras partes do sangue e retida. Todas as outras partes são descartadas em uma solução de alvejante. As PBMCs são posteriormente processadas para isolar as células T, essas células podem então seguir uma das cinco rotas:

1. As células são tratadas para extrair o DNA/RNA, e o DNA/RNA é analisado para obter informações sobre os receptores de células T e outras moléculas associadas. As células são mortas durante a extração de DNA/RNA.
2. As células serão submetidas a edição genética para fornecer informações sobre os processos envolvidos na função normal das células T. As células serão cultivadas por 28 dias após a edição do gene, passarão por múltiplas rodadas de divisão e se tornarão não relevantes nos termos da lei da Autoridade de Tecidos Humanos (HTA) de 2004.
3. As células serão usadas em um ensaio onde serão expostas a pedaços sobrepostos de proteínas SARS-CoV-2, e então serão cultivadas em cultura por 14 dias, após o qual as células terão sofrido divisão e não serão mais relevantes para HTA. As células que respondem às proteínas SARS-CoV-2 serão testadas para verificar se têm capacidade de destruir as células beta pancreáticas produtoras de insulina.
4. Usando um classificador automatizado e marcadores fluorescentes, as células são classificadas e analisadas. As células morrerão durante este processo que ocorre no dia em que as células são processadas no laboratório.
5. As células serão usadas em ensaios baseados em placas para aprender sobre os processos envolvidos nas funções das células T. As células serão descartadas após o ensaio, que pode levar de 1 a 3 dias, dependendo do tipo de ensaio utilizado.

Esta metodologia foi desenhada seguindo o Envolvimento do Paciente e do Público, que foi realizado remotamente devido ao distanciamento social.